劉新迎，周聯(lián)，王培訓(xùn)

1.佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣州 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

川芎嗪對(duì)3T3-L1增殖分化及分泌Leptin、PAI-1的影響

劉新迎1，周聯(lián)2，王培訓(xùn)2

1.佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院，廣州 佛山 528226；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

目的：研究川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖分化和分泌瘦素（Leptin）、纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的影響。方法：培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，并分別用川芎嗪5 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 3個(gè)濃度進(jìn)行干預(yù)，四甲基偶氮唑鹽（MTT）測定3T3-L1的增殖；油紅O進(jìn)行染色以及染色比色法測定細(xì)胞分化程度；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中Leptin、PAI-1含量。結(jié)果：川芎嗪100 μg/mL濃度組能明顯抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3個(gè)濃度組對(duì)細(xì)胞分化均無明顯影響；TMP 3個(gè)濃度組對(duì)Leptin的分泌和50 μg/mL、100 μg/mL濃度組對(duì)PAI-1的分泌均有明顯抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論：川芎嗪對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以影響其分泌功能為主。

川芎嗪；前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）；增殖分化；瘦素（Leptin）；纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）

川芎嗪（TMP）是從活血化瘀類中藥川芎中提取的一種生物堿單體，具有擴(kuò)張血管，拮抗血小板凝集，清除氧自由基，加快血液循環(huán)等作用［1～3］，目前研究還發(fā)現(xiàn)，在脂肪顆粒移植方式隆胸手術(shù)中，川芎嗪對(duì)提高脂肪的成活率具有較明顯的作用［4］。前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）是從小鼠胚胎的Swiss3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出來的，能特異性地分化成脂肪細(xì)胞，是目前被廣泛應(yīng)用于脂肪細(xì)胞研究的前脂肪細(xì)胞系。本試驗(yàn)以3T3-L1細(xì)胞為細(xì)胞模型探討TMP對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化、分泌功能等方面的影響。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1，來源于上海細(xì)胞研究所。

1.2藥物與試劑TMP來源于中國藥品生物制品檢定所；高糖DMEM培養(yǎng)基（H-DMEM），Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，PAA公司產(chǎn)品；地塞米松，ICN公司產(chǎn)品；合成人胰島素，NovoNordisk公司產(chǎn)品；1-甲基-3-異丁基 -黃嘌呤（IBMX），Sigma公司產(chǎn)品；油紅O，AMRESCO公司產(chǎn)品；小鼠Leptin檢測試劑盒（ELISA），武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；小鼠PAI-1檢測試劑盒（ELISA），Uscn Life Science &Technology Company公司產(chǎn)品。TMP用純水溶解，再用完全培養(yǎng)液分別稀釋至5 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL三個(gè)濃度；完全培養(yǎng)液和誘導(dǎo)液配制參見文獻(xiàn)［5］。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.13T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的影響將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入5 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL三個(gè)濃度的TMP，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)分別設(shè)未加TMP的完全培養(yǎng)液組以及溶媒組作對(duì)照。加藥培養(yǎng)后96 h，以MTT法測定其增殖情況。

2.3TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響在3T3-L1細(xì)胞完全融合2 d后換用誘導(dǎo)液開始誘導(dǎo)的同時(shí)，分別加入三個(gè)濃度的TMP，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，同時(shí)分別設(shè)未加TMP的完全培養(yǎng)液組、單純誘導(dǎo)液組、以及溶媒組作對(duì)照。對(duì)誘導(dǎo)分化8 d的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，于顯微鏡下觀察用異丙醇處理染色的細(xì)胞，510 nm波長檢測吸光度值（OD值），對(duì)分化程度進(jìn)行定量［6］。

2.4不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的測定將細(xì)胞按1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全融合2 d后，換用誘導(dǎo)液培養(yǎng)48 h，然后換以含10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，隨后再換用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)96 h，共誘導(dǎo)分化8 d，85%以上分化為成熟脂肪細(xì)胞，然后用含0.5%FBS培養(yǎng)液血清饑餓12 h，用不同濃度的TMP繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取上清液進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)未加TMP的空白組和溶媒組作對(duì)照。用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中Leptin、PAI-1含量，具體方法按試劑盒說明書操作。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行處理，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3　結(jié)果

3.1不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響見表1。TMP100 μg/mL濃度組能明顯抑制細(xì)胞的增殖，與培養(yǎng)液組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而其他兩個(gè)濃度組對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響；TMP三個(gè)濃度組對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化無明顯影響。

表1　不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響（±s，n=3）

表1　不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響（±s，n=3）

與培養(yǎng)液組比較，①P＜0.01；與誘導(dǎo)液組比較，②P＜0.01

組別培養(yǎng)液組誘導(dǎo)液組溶媒組TM P劑量/μg/mL—　—5 5 0 100細(xì)胞增殖（A 570nm）0.397±0.043—0.398±0.007 0.363±0.016 0.344±0.024 0.298±0.008①細(xì)胞分化（A 510nm）0.496±0.095②1.953±0.519 1.952±0.146 1.674±0.204 1.580±0.031 1.756±0.207

3.2不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞分泌Leptin、PAI-1的影響見表2。TMP在5、50、100 μg/mL三個(gè)濃度均明顯抑制3T3-L1細(xì)胞Leptin分泌，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TMP在50、100 μg/mL兩個(gè)濃度對(duì)PAI-1分泌有明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；溶媒對(duì)細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌無影響。

表2　不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的影響（±s，n=3）

表2　不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的影響（±s，n=3）

與空白組比較，①P＜0.05；②P＜0.01

組別空白組TM P5 μg/mL TM P50 μg/mL TM P100 μg/mL溶媒組Leptin（pg/mL）649.50±7.31 602.91±6.23②560.60±25.88②521.09±23.45②644.06±6.85 PA I-1（ng/mL）4.15±0.25 4.09±0.59 3.63±0.44①3.37±0.13②4.17±0.08

4　討論

脂肪組織不僅僅是被動(dòng)的能量儲(chǔ)存器官，而且是能分泌多種蛋白質(zhì)及細(xì)胞因子的內(nèi)分泌器官，同時(shí)還具有重要的組織損傷修復(fù)功能，脂肪組織數(shù)量的平衡與穩(wěn)定與機(jī)體的正常代謝密切相關(guān)［7～8］。脂肪細(xì)胞在脂肪組織中占三分之一，脂肪細(xì)胞的數(shù)目和體積以及能量攝入及釋放之間的平衡決定了生物體內(nèi)脂肪組織的數(shù)量，脂肪細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)含有一個(gè)或多個(gè)脂滴，脂滴是細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的一種形式。脂肪細(xì)胞在脂肪組織中非?；钴S，其數(shù)目、形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)脂肪的含量以及細(xì)胞因子的分泌均處于動(dòng)態(tài)變化過程中，脂肪細(xì)胞的增殖分化以及分泌功能異常是導(dǎo)致許多脂肪代謝紊亂性疾病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

Leptin是第一個(gè)分離的脂源性激素，主要由脂肪細(xì)胞合成分泌，Leptin的表達(dá)和分泌量與脂肪含量及肥胖程度相關(guān)，Leptin是經(jīng)典意義上的蛋白質(zhì)類內(nèi)分泌激素，具有十分廣泛的生理效應(yīng)，脂肪代謝調(diào)節(jié)、機(jī)體內(nèi)脂肪的沉積等都與Leptin密切相關(guān)。PAI-1是組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）的特異性快速抑制劑，能抑制纖維蛋白溶解和細(xì)胞外基質(zhì)降解，血漿中高濃度的PAI-1是血栓形成的危險(xiǎn)因素，在糖尿病、心血管病變的發(fā)生中起重要作用。雖然許多細(xì)胞均能分泌PAI-1，但在肥胖、胰島素抵抗時(shí)，脂肪組織被認(rèn)為是其主要來源，循環(huán)中的PAI-1水平與腹型肥胖相關(guān)，被認(rèn)為是聯(lián)系肥胖、2型糖尿病和心血管事件的重要紐帶。

川芎嗪是川芎中提取的有效生物堿四甲基吡嗪，具有多種生物學(xué)功效，如對(duì)心臟疾病的治療效果，肝、腎損傷的修復(fù)保護(hù)作用，對(duì)肥胖性高血壓癥狀的改善等［9～12］。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，而且對(duì)脂肪細(xì)胞分泌Leptin和PAI-1均有明顯抑制作用，說明川芎嗪對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以影響其分泌功能為主。本研究以脂肪細(xì)胞為切入點(diǎn)，探討了川芎嗪的作用機(jī)制，但由于脂肪組織以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，其進(jìn)一步的作用靶點(diǎn)和機(jī)制，有待于深入研究。

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（責(zé)任編輯：馮天保，鄭鋒玲）

Effect of Tetramethylpyrazine on Proliferation and Differentiation and Secreting Leptin and PAI-1 of Preadipocyte 3T3-L1

LIU Xinying，ZHOU Lian，WANG Peixun

Objective：To research the effect of tetramethylpyrazine（TMP）on proliferation and differentiation and secreting Leptin and plasminogen activator inhibitor type 1（PAI-1）of preadipocyte 3T3-L1 in rats.Methods：Cultured 3T3-L1 cells，and intervene with TMP of 5 μg/mL，50 μg/mL and 100 μg/mL.Proliferation of 3T3-L1 was detected by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）.Dying with Oil Red O and detected cell differentiated degree by staining and colorimetric method，detected levels of Leptin and PAI-1 in cell culture supernatants by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：TMP with concentration of 100μg/mL could inhibit cell proliferation obviously，3 groups of TMP with different concentrations had no obvious effect oncell differentiation.But 3 groups of TMP with different concentrations could inhibit Leptin secretion，and TMP with concentration of 50μg/mL，100μg/mL could inhibit PAI-1 secretion obviously.Conclusion：The regulation of TMP on fat cell mainly affects secretion function.

Tetramethylpyrazine（TMP）； Preadipocyte 3T3-L1； Proliferation； Differentiation； Leptin； Plasminogen activator inhibitor type 1（PAI-1）

R285.5

A

0256-7415（2016）09-0230-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.100

2016-03-26

劉新迎（1972-），女，副主任中醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)臨床。