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        川芎嗪對(duì)3T3-L1增殖分化及分泌Leptin、PAI-1的影響

        2016-10-20 06:09:25劉新迎周聯(lián)王培訓(xùn)
        新中醫(yī) 2016年9期
        關(guān)鍵詞:溶媒川芎嗪脂肪組織

        劉新迎,周聯(lián),王培訓(xùn)

        1.佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院,廣州 佛山 528226;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

        川芎嗪對(duì)3T3-L1增殖分化及分泌Leptin、PAI-1的影響

        劉新迎1,周聯(lián)2,王培訓(xùn)2

        1.佛山市南海區(qū)羅村醫(yī)院,廣州 佛山 528226;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

        目的:研究川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1增殖分化和分泌瘦素(Leptin)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)的影響。方法:培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞,并分別用川芎嗪5 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 3個(gè)濃度進(jìn)行干預(yù),四甲基偶氮唑鹽(MTT)測定3T3-L1的增殖;油紅O進(jìn)行染色以及染色比色法測定細(xì)胞分化程度;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中Leptin、PAI-1含量。結(jié)果:川芎嗪100 μg/mL濃度組能明顯抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);3個(gè)濃度組對(duì)細(xì)胞分化均無明顯影響;TMP 3個(gè)濃度組對(duì)Leptin的分泌和50 μg/mL、100 μg/mL濃度組對(duì)PAI-1的分泌均有明顯抑制作用,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論:川芎嗪對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以影響其分泌功能為主。

        川芎嗪;前脂肪細(xì)胞(3T3-L1);增殖分化;瘦素(Leptin);纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)

        川芎嗪(TMP)是從活血化瘀類中藥川芎中提取的一種生物堿單體,具有擴(kuò)張血管,拮抗血小板凝集,清除氧自由基,加快血液循環(huán)等作用[1~3],目前研究還發(fā)現(xiàn),在脂肪顆粒移植方式隆胸手術(shù)中,川芎嗪對(duì)提高脂肪的成活率具有較明顯的作用[4]。前脂肪細(xì)胞(3T3-L1)是從小鼠胚胎的Swiss3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)分化出來的,能特異性地分化成脂肪細(xì)胞,是目前被廣泛應(yīng)用于脂肪細(xì)胞研究的前脂肪細(xì)胞系。本試驗(yàn)以3T3-L1細(xì)胞為細(xì)胞模型探討TMP對(duì)脂肪細(xì)胞增殖、分化、分泌功能等方面的影響。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1細(xì)胞株小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1,來源于上海細(xì)胞研究所。

        1.2藥物與試劑TMP來源于中國藥品生物制品檢定所;高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM),Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清,PAA公司產(chǎn)品;地塞米松,ICN公司產(chǎn)品;合成人胰島素,NovoNordisk公司產(chǎn)品;1-甲基-3-異丁基 -黃嘌呤(IBMX),Sigma公司產(chǎn)品;油紅O,AMRESCO公司產(chǎn)品;小鼠Leptin檢測試劑盒(ELISA),武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;小鼠PAI-1檢測試劑盒(ELISA),Uscn Life Science &Technology Company公司產(chǎn)品。TMP用純水溶解,再用完全培養(yǎng)液分別稀釋至5 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL三個(gè)濃度;完全培養(yǎng)液和誘導(dǎo)液配制參見文獻(xiàn)[5]。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.13T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

        2.2TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的影響將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200 μL,待細(xì)胞完全貼壁后,分別加入5 μg/mL,50 μg/mL,100 μg/mL三個(gè)濃度的TMP,每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行孔,同時(shí)分別設(shè)未加TMP的完全培養(yǎng)液組以及溶媒組作對(duì)照。加藥培養(yǎng)后96 h,以MTT法測定其增殖情況。

        2.3TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響在3T3-L1細(xì)胞完全融合2 d后換用誘導(dǎo)液開始誘導(dǎo)的同時(shí),分別加入三個(gè)濃度的TMP,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,同時(shí)分別設(shè)未加TMP的完全培養(yǎng)液組、單純誘導(dǎo)液組、以及溶媒組作對(duì)照。對(duì)誘導(dǎo)分化8 d的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色,于顯微鏡下觀察用異丙醇處理染色的細(xì)胞,510 nm波長檢測吸光度值(OD值),對(duì)分化程度進(jìn)行定量[6]。

        2.4不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的測定將細(xì)胞按1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板,1 mL/孔,5%CO2孵育箱中培養(yǎng),待細(xì)胞完全融合2 d后,換用誘導(dǎo)液培養(yǎng)48 h,然后換以含10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,隨后再換用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),2 d換培養(yǎng)液1次,培養(yǎng)96 h,共誘導(dǎo)分化8 d,85%以上分化為成熟脂肪細(xì)胞,然后用含0.5%FBS培養(yǎng)液血清饑餓12 h,用不同濃度的TMP繼續(xù)培養(yǎng)48 h,取上清液進(jìn)行檢測,同時(shí)設(shè)未加TMP的空白組和溶媒組作對(duì)照。用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中Leptin、PAI-1含量,具體方法按試劑盒說明書操作。

        2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行處理,組間比較采用t檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果

        3.1不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響見表1。TMP100 μg/mL濃度組能明顯抑制細(xì)胞的增殖,與培養(yǎng)液組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而其他兩個(gè)濃度組對(duì)細(xì)胞增殖無明顯影響;TMP三個(gè)濃度組對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化無明顯影響。

        表1 不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響(±s,n=3)

        表1 不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖分化的影響(±s,n=3)

        與培養(yǎng)液組比較,①P<0.01;與誘導(dǎo)液組比較,②P<0.01

        組別培養(yǎng)液組誘導(dǎo)液組溶媒組TM P劑量/μg/mL— —5 5 0 100細(xì)胞增殖(A 570nm)0.397±0.043—0.398±0.007 0.363±0.016 0.344±0.024 0.298±0.008①細(xì)胞分化(A 510nm)0.496±0.095②1.953±0.519 1.952±0.146 1.674±0.204 1.580±0.031 1.756±0.207

        3.2不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞分泌Leptin、PAI-1的影響見表2。TMP在5、50、100 μg/mL三個(gè)濃度均明顯抑制3T3-L1細(xì)胞Leptin分泌,與空白組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);TMP在50、100 μg/mL兩個(gè)濃度對(duì)PAI-1分泌有明顯抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);溶媒對(duì)細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌無影響。

        表2 不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的影響(±s,n=3)

        表2 不同濃度TMP對(duì)3T3-L1細(xì)胞Leptin、PAI-1分泌的影響(±s,n=3)

        與空白組比較,①P<0.05;②P<0.01

        組別空白組TM P5 μg/mL TM P50 μg/mL TM P100 μg/mL溶媒組Leptin(pg/mL)649.50±7.31 602.91±6.23②560.60±25.88②521.09±23.45②644.06±6.85 PA I-1(ng/mL)4.15±0.25 4.09±0.59 3.63±0.44①3.37±0.13②4.17±0.08

        4 討論

        脂肪組織不僅僅是被動(dòng)的能量儲(chǔ)存器官,而且是能分泌多種蛋白質(zhì)及細(xì)胞因子的內(nèi)分泌器官,同時(shí)還具有重要的組織損傷修復(fù)功能,脂肪組織數(shù)量的平衡與穩(wěn)定與機(jī)體的正常代謝密切相關(guān)[7~8]。脂肪細(xì)胞在脂肪組織中占三分之一,脂肪細(xì)胞的數(shù)目和體積以及能量攝入及釋放之間的平衡決定了生物體內(nèi)脂肪組織的數(shù)量,脂肪細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞,其細(xì)胞內(nèi)含有一個(gè)或多個(gè)脂滴,脂滴是細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的一種形式。脂肪細(xì)胞在脂肪組織中非?;钴S,其數(shù)目、形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)脂肪的含量以及細(xì)胞因子的分泌均處于動(dòng)態(tài)變化過程中,脂肪細(xì)胞的增殖分化以及分泌功能異常是導(dǎo)致許多脂肪代謝紊亂性疾病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

        Leptin是第一個(gè)分離的脂源性激素,主要由脂肪細(xì)胞合成分泌,Leptin的表達(dá)和分泌量與脂肪含量及肥胖程度相關(guān),Leptin是經(jīng)典意義上的蛋白質(zhì)類內(nèi)分泌激素,具有十分廣泛的生理效應(yīng),脂肪代謝調(diào)節(jié)、機(jī)體內(nèi)脂肪的沉積等都與Leptin密切相關(guān)。PAI-1是組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)的特異性快速抑制劑,能抑制纖維蛋白溶解和細(xì)胞外基質(zhì)降解,血漿中高濃度的PAI-1是血栓形成的危險(xiǎn)因素,在糖尿病、心血管病變的發(fā)生中起重要作用。雖然許多細(xì)胞均能分泌PAI-1,但在肥胖、胰島素抵抗時(shí),脂肪組織被認(rèn)為是其主要來源,循環(huán)中的PAI-1水平與腹型肥胖相關(guān),被認(rèn)為是聯(lián)系肥胖、2型糖尿病和心血管事件的重要紐帶。

        川芎嗪是川芎中提取的有效生物堿四甲基吡嗪,具有多種生物學(xué)功效,如對(duì)心臟疾病的治療效果,肝、腎損傷的修復(fù)保護(hù)作用,對(duì)肥胖性高血壓癥狀的改善等[9~12]。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,而且對(duì)脂肪細(xì)胞分泌Leptin和PAI-1均有明顯抑制作用,說明川芎嗪對(duì)脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用以影響其分泌功能為主。本研究以脂肪細(xì)胞為切入點(diǎn),探討了川芎嗪的作用機(jī)制,但由于脂肪組織以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性,其進(jìn)一步的作用靶點(diǎn)和機(jī)制,有待于深入研究。

        [1]史大卓.川芎嗪的藥理作用謅議[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,23(5):377-378.

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        [3]李福龍,李繼紅,劉艷凱,等.川芎嗪、當(dāng)歸注射液對(duì)DIC大鼠血小板功能和器官血流量的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2006,26(8):909-910.

        [4]劉浩,金光柱.自體脂肪顆粒移植聯(lián)合川芎嗪隆胸臨床療效研究[J].中國保健營養(yǎng),2013,33(5):2278.

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        [9]趙潤英,郝偉,孟祥軍,等.阿魏酸川芎嗪對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(19):230-234.

        [10]馬俊梅.川芎嗪對(duì)肥胖性高血壓大鼠癥狀的改善作用研究[J].中外醫(yī)療,2014,33(5):21-22.

        [11]孫玉芹,高天蕓,周娟,等.川芎嗪對(duì)小鼠急性肝損傷性脂肪肝保護(hù)作用的研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2007,12(5):540-543.

        [12]廖于,李龍輝,左國慶,等.川芎嗪對(duì)體外誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝細(xì)胞的影響[J].中華肝臟病雜志,2010,18(8):628-629.

        (責(zé)任編輯:馮天保,鄭鋒玲)

        Effect of Tetramethylpyrazine on Proliferation and Differentiation and Secreting Leptin and PAI-1 of Preadipocyte 3T3-L1

        LIU Xinying,ZHOU Lian,WANG Peixun

        Objective:To research the effect of tetramethylpyrazine(TMP)on proliferation and differentiation and secreting Leptin and plasminogen activator inhibitor type 1(PAI-1)of preadipocyte 3T3-L1 in rats.Methods:Cultured 3T3-L1 cells,and intervene with TMP of 5 μg/mL,50 μg/mL and 100 μg/mL.Proliferation of 3T3-L1 was detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT).Dying with Oil Red O and detected cell differentiated degree by staining and colorimetric method,detected levels of Leptin and PAI-1 in cell culture supernatants by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results:TMP with concentration of 100μg/mL could inhibit cell proliferation obviously,3 groups of TMP with different concentrations had no obvious effect oncell differentiation.But 3 groups of TMP with different concentrations could inhibit Leptin secretion,and TMP with concentration of 50μg/mL,100μg/mL could inhibit PAI-1 secretion obviously.Conclusion:The regulation of TMP on fat cell mainly affects secretion function.

        Tetramethylpyrazine(TMP); Preadipocyte 3T3-L1; Proliferation; Differentiation; Leptin; Plasminogen activator inhibitor type 1(PAI-1)

        R285.5

        A

        0256-7415(2016)09-0230-03

        10.13457/j.cnki.jncm.2016.09.100

        2016-03-26

        劉新迎(1972-),女,副主任中醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)臨床。

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