吳蓓琦　劉暢　李萍

摘要：通過優(yōu)化提取方式、提取溶液、濃縮條件、檢測(cè)條件等，建立高效液相色譜熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的方法。樣品經(jīng)硼氫化鉀溶液、乙腈提取，二氯甲烷萃取，用45 ℃氮?dú)獯蹈?，丙基磺酸?yáng)離子（PRS）固相萃取柱凈化，采用Agilent XDB C18色譜柱（1.8 μm），以乙腈-乙酸銨緩沖液（0.125 mol/L，pH值4.5，體積比80 ∶ 20）為流動(dòng)相，用超高效液相色譜熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。方法的檢測(cè)限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，4個(gè)加標(biāo)水平（1.0、2.5、5.0、10.0 μg/kg）的回收率為86.4%～95.3%（n=6），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～5.6%。該方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確度高，易于推廣應(yīng)用，能滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；水產(chǎn)品；孔雀石綠；殘留檢測(cè)；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： TS207.3；O652.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0333-03

孔雀石綠（malachite green，MG）是一種三苯甲烷類染料，它在生物體內(nèi)快速代謝為無(wú)色孔雀石綠（leuco-malachite green，LMG），具有致癌、致畸、致突變等毒性[1-2]，因此美國(guó)、歐盟等禁止將孔雀石綠用于食品用水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖，我國(guó)也在2002年將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》。但是，由于孔雀石綠對(duì)魚類水霉病等疾病具有特效，且價(jià)格低廉，目前在魚苗繁育、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)冗^程中非法使用的問題屢有發(fā)生[3]。

目前，水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等[4-7]。目前農(nóng)業(yè)部開展全國(guó)水產(chǎn)品產(chǎn)地監(jiān)督抽檢、城市例行監(jiān)測(cè)等任務(wù)時(shí)，以GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》[8]作為水產(chǎn)品中孔雀石綠的定量檢測(cè)方法，但該方法前處理過程繁瑣、操作步驟多。本試驗(yàn)通過對(duì)GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》前處理過程進(jìn)行優(yōu)化與改進(jìn)，主要包括提取方式、提取溶液、濃縮條件等因素，以期建立1種前處理簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確度高并且穩(wěn)定的孔雀石綠及其代謝物殘留的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200超高效液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器； TurboVap LV濃縮工作站。

孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，純度>99%；乙腈、二氯甲烷，色譜純，購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司；其余試劑均為分析純。丙基磺酸陽(yáng)離子固相萃取柱（PRS，500 mg/3 mL），購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

提取液：稱取0.54 g硼氫化鉀，加入25 mL水溶解，再加入75 mL乙腈混勻。

洗脫液：稱取1.54 g無(wú)水乙酸銨，溶解于200 mL水中，用濃氨水（25%～28%）將pH值調(diào)至10.0，再與乙腈按體積比1 ∶ 1進(jìn)行混合。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱取5.00 g樣品，加入15 mL提取液，渦旋2 min，4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中；在離心管中加入10 mL乙腈，渦旋2 min，8 000 r/min 離心10 min，合并上清液于分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL二氯甲烷，劇烈振搖2 min，靜置分層1 h，將下層溶液轉(zhuǎn)移至50 mL濃縮管中。用45 ℃氮?dú)獯抵?.5～1.0 mL，加入5 mL乙腈溶解殘?jiān)?。PRS柱用5 mL乙腈活化，轉(zhuǎn)移提取液到柱上，再分別用3 mL乙腈潤(rùn)洗濃縮管2次，依次過柱。最后將PRS柱吹至近干，加入3 mL洗脫液，收集洗脫液并定容至3 mL，供液相色譜測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent XDB-C18柱，4.6 mm×50 mm（內(nèi)徑），粒度1.8 μm；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨緩沖液（0.125 mol/L，pH值4.5，體積比80 ∶ 20），流速為0.15 mL/min；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方式優(yōu)化

GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的基本原理是通過乙酸銨乙腈溶液提取，用硼氫化鉀將提取液中的孔雀石綠還原成無(wú)色孔雀石綠，采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。本方法中需要加入鹽酸羥胺溶液、乙酸銨緩沖液、乙腈等多種試劑，同時(shí)需要對(duì)樣品進(jìn)行4次提取，提取過程繁瑣。本方法采用硼氫化鉀-乙腈混合溶液進(jìn)行提取，直接在樣品渦旋過程中將孔雀石綠還原成無(wú)色孔雀石綠，避免在提取溶液中加入硼氫化鉀溶液，減少操作步驟；同時(shí)，硼氫化鉀作為強(qiáng)還原劑，能有效替代GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中鹽酸羥胺的作用，避免無(wú)色孔雀石綠被氧化。通過2次提取的比較發(fā)現(xiàn)，本方法既具有操作過程簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)（表1），又能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性（表2）。

2.2 硼氫化鉀用量的確定

在實(shí)際樣品前處理過程中，水相與有機(jī)相的比例影響二者的分層效果，比例不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致2相倒置、2層界面模糊、乳化等現(xiàn)象。通過考察硼氫化鉀溶液與乙腈不同的體積比例，結(jié)果表明：當(dāng)硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 2或更高時(shí)，對(duì)于鰻鱺、中華絨螯蟹等脂肪含量較高的樣品，加入二氯甲烷并劇烈振搖后較易乳化。當(dāng)硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 3或更低時(shí)，劇烈振搖后也不會(huì)乳化，有機(jī)相與水相分層明顯，有利于下一步的濃縮與凈化。但是試驗(yàn)中水相的存在有助于去除樣品中水溶性雜質(zhì)，因此水相的比例也不能過低。經(jīng)綜合考慮，本試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液與乙腈的體積比為1 ∶ 3。

硼氫化鉀在本方法及GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中的作用均是將樣品中的孔雀石綠還原成無(wú)色孔雀石綠，硼氫化鉀的用量直接關(guān)系到孔雀石綠的還原效果。為了確定硼氫化鉀濃度對(duì)孔雀石綠的還原效果，在空白基質(zhì)中添加10 μg/kg孔雀石綠，分別加入硼氫化鉀濃度為0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的提取液，按“1.2”“1.3”節(jié)中相應(yīng)方法進(jìn)行前處理與檢測(cè)。在前處理過程中樣品經(jīng)渦旋后，原本呈肉紅色的樣品顏色逐漸變淺，直至變成灰白色。同時(shí)測(cè)定結(jié)果表明，樣品中孔雀石綠的回收率無(wú)顯著差異，均在90%左右?？紤]到水產(chǎn)品基質(zhì)的多樣性以及孔雀石綠殘留水平的不同，本試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液濃度為0.4 mol/L，以保證孔雀石綠的還原效果。

2.3 濃縮條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)應(yīng)用TurboVap LV濃縮工作站進(jìn)行濃縮，其主要原理是在一定的溫度下利用氮?dú)獯祾哌M(jìn)行濃縮，相對(duì)于傳統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而言，具有溶劑揮發(fā)平穩(wěn)、能同時(shí)濃縮24個(gè)樣品、濃縮效率高等特點(diǎn)。本試驗(yàn)在6.9×104 Pa氮?dú)鈮毫ο?，濃縮管中溶劑不會(huì)劇烈翻騰，同時(shí)又保證了一定的溶劑揮發(fā)速度。同時(shí)，本試驗(yàn)對(duì)濃縮溫度進(jìn)行了優(yōu)化，考察了35、40、45、50、55 ℃ 條件下濃縮時(shí)間及結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，在45 ℃的濃縮溫度下，濃縮時(shí)間約為40 min，回收率約為90%。50、55 ℃條件下濃縮時(shí)間較短，約為30 min，但樣品回收率較低，均在80%以下，有的甚至低于70%，結(jié)果不穩(wěn)定。這可能是由于在較高的溫度下，溶劑揮發(fā)速率過快，將目標(biāo)物質(zhì)連同溶劑一起帶出，造成回收率降低。在35、40 ℃條件下，濃縮時(shí)間較長(zhǎng)，均超過1 h，但回收率與45 ℃無(wú)顯著差異。因此采用氮?dú)鈮毫?.9×104 Pa、濃縮溫度45 ℃作為本方法的濃縮條件。

2.4 固相萃取小柱的選擇

GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》中將酸性氧化鋁柱與PRS柱進(jìn)行串聯(lián)，待樣液流完后，棄去酸性氧化鋁柱，再進(jìn)行洗脫，而本試驗(yàn)只采用PRS柱進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示：色譜圖中雜峰干擾小，目標(biāo)峰與雜峰完全分離，且峰形尖銳對(duì)稱（圖1至圖4）；此外只選用PRS柱，有利于降低檢測(cè)成本。

2.5 儀器方法的選擇

筆者所在研究團(tuán)隊(duì)曾建立了普通高效液相色譜熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的方法[9]，其分析時(shí)間為15 min，而本試驗(yàn)建立的超高效液相色譜法分析用時(shí)為8 min，分析時(shí)間大大縮短。同時(shí)本試驗(yàn)采用1.8 μm小顆粒填料進(jìn)行超高效液相色譜分析，結(jié)果表明：孔雀石綠在Agilent XDB C18色譜柱擁有理想的分離效果（圖1至圖4）。此外，本方法完成1次樣品分析消耗的流動(dòng)相僅為1.2 mL（流速為0.15 mL/min），而普通液相色譜方法[9]消耗的流動(dòng)相為15 mL（流速為 1 mL/min），可見采用超高效液相色譜方法可以在很大程度上減少分析時(shí)間、節(jié)省溶劑消耗，這既降低了分析成本，又減少了廢液的排放，具有重要的環(huán)保意義。

2.6 線性范圍、檢出限及定量限

采用逐級(jí)稀釋的方式，并加入0.4 mL 0.03 mol/L硼氫化鉀溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00、500.00 μg/L的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液，按質(zhì)量濃度從低到高的順序進(jìn)樣。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明：孔雀石綠在1～500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r>0.999。

檢出限（LOD）采用向空白、樣品中逐級(jí)降低孔雀石綠加標(biāo)濃度的方法來(lái)確定，以≥3倍信噪比（S/N≥3）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度為檢出限，以S/N≥10對(duì)應(yīng)的濃度為定量限（LOQ）。結(jié)果表明：該方法的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg。

2.7 準(zhǔn)確度與精密度

在空白、鯉魚、對(duì)蝦、中華絨螯蟹樣品中加入孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為1.0、2.5、5.0、10.0 μg/kg，加標(biāo)30 min后按“1.2”“1.3”節(jié)的相應(yīng)方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明：孔雀石綠的加標(biāo)回收率為86.4%～95.3%，在各個(gè)加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率比較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%～5.6%，能滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留的檢測(cè)要求（表2、圖1至圖4）。

3 結(jié)論

本方法通過對(duì)GB/T 20361—2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的提取方式、提取溶液、濃縮條件等前處理過程的優(yōu)化，建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法。試驗(yàn)

結(jié)果表明：該方法具有前處理步驟簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的檢測(cè)。

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