張棋　胡永紅　楊文革

摘要：為了優(yōu)化金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法建立發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化模型。得到最優(yōu)的培養(yǎng)基為：蔗糖20.07 g/L、酵母膏20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下，金龜子綠僵菌的生物量可達(dá)16.523 g/L，比優(yōu)化前提高了37.24%。

關(guān)鍵詞：金龜子綠僵菌；培養(yǎng)基；響應(yīng)面法；優(yōu)化條件

中圖分類號(hào)： S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0173-04

金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類重要的昆蟲病原真菌，它作為生物防治制劑具有環(huán)境安全性好、昆蟲不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。此外，綠僵菌的寄主廣泛性和廣譜性使得其成為一種研究昆蟲病原真菌侵染寄主過程的重要模式生物[1-2]。目前，植物病害在全球范圍內(nèi)每年造成高達(dá)數(shù)千億美元的損失，而其中又以昆蟲病害最為嚴(yán)重。金龜子綠僵菌具有寄生范圍廣、無殘毒、后效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外殺菌、除蟲的一線藥物之一[3-4]。然而，在金龜子綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，菌體生物量低，生產(chǎn)成本高，發(fā)酵周期長(zhǎng)等問題限制了其推廣應(yīng)用[5-7]；因此，對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及條件探索具有重大意義。本研究以金龜子綠僵菌NJYHWG 3820為試驗(yàn)菌株，應(yīng)用響應(yīng)面法系統(tǒng)考察了影響金龜子綠僵菌生物量的培養(yǎng)基成分，得到了最佳培養(yǎng)基配方，從而提高了生物量。

1 材料與方法

1.1 菌種

金龜子綠僵菌：Metarhizium anisopliae NJYHWG 3820，由筆者課題組保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，自然pH值。

種子培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 2 g/L，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 2 g/L，pH值6.5。

1.3 主要試劑和儀器

蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘油、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、甘氨酸、瓊脂粉，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4·3H2O、CaCl2、NaNO3、CuSO4、CaCO3，由廣東汕頭市西隴化工廠提供；馬鈴薯，市售。

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；滅菌鍋，華粵行儀器有限公司；醫(yī)用凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；基礎(chǔ)分析型純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 金龜子綠僵菌生物量測(cè)定 取發(fā)酵液倒入50 mL的離心管中，10 000 r/min離心15 min，去上清。沉淀的菌體用去離子水懸浮，再離心2次，去上清。把菌體倒在干凈的已稱質(zhì)量的稱量紙上，放入80 ℃的烘箱烘干至恒質(zhì)量，在電子天平上稱質(zhì)量，計(jì)算干菌體質(zhì)量：菌體生物量（g/L）=菌體干質(zhì)量（g）/發(fā)酵液取樣體積（L）。

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對(duì)碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d，測(cè)定每種因素對(duì)生物量的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.3.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)試驗(yàn) 利用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)從多個(gè)單因素中篩選出對(duì)菌體生長(zhǎng)影響最顯著的幾個(gè)因素，使用Design Expert 6.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，包括11個(gè)變量（n=11），其中8個(gè)主要變量（蔗糖、乳糖、甘油、蛋白胨、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、CaCl2）和3個(gè)虛擬變量，分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K來代表變量，每個(gè)變量有高（+）和低（-）2個(gè)水平，設(shè)置高（+）水平是低（-）水平的1.5倍（表1）。

1.4.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 在PB試驗(yàn)中得到影響較為顯著的3個(gè)因素，并且根據(jù)PB設(shè)計(jì)得出的一次項(xiàng)擬合方程中相應(yīng)變量的系數(shù)，從而確定變化梯度和爬坡方向。若變量系數(shù)為負(fù)，則該變量水平以梯度遞減的方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)。若變量系數(shù)為正，則該變量水平以梯度遞增的方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，這樣就能夠經(jīng)濟(jì)、快速地逼近最佳區(qū)域。將最陡爬坡試驗(yàn)中得到的金龜子綠僵菌生物量最高點(diǎn)作為中心組合設(shè)計(jì)的的中心點(diǎn)來設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。

1.4.3.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過最陡爬坡試驗(yàn)，逼近金龜子綠僵菌發(fā)酵生物量最大化區(qū)域，根據(jù) Box-Bellnken 原理，對(duì)經(jīng)過PB和爬坡試驗(yàn)的變量進(jìn)行3水平試驗(yàn)（-1、0、+1），共17組試驗(yàn)，使用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，研究金龜子綠僵菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 碳源是菌體碳架構(gòu)成及能量供應(yīng)的來源。由圖1可知，在選擇的7種碳源中蔗糖、甘油和乳糖對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵效果較為理想，其中蔗糖效果最好。其他幾種碳源對(duì)生物量的影響較小，該金龜子綠僵菌對(duì)其他4種碳源利用率不高。

2.1.2 氮源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 氮源是構(gòu)成菌體蛋白、核酸等含氮物質(zhì)的來源。由圖2可知，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響更為顯著，在有機(jī)氮源培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)良好；而在無機(jī)氮源培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)較稀疏。在有機(jī)氮源中，酵母膏效果最好，蛋白胨次之。

2.1.3 無機(jī)鹽對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 無機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)，它的種類和含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成影響很大。由圖3可知，MgSO4對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵影響最大，KH2PO4和CaCl2次之；因此在下個(gè)階段的PB設(shè)計(jì)中，將MgSO4、KH2PO4、CaCl2作為考察因素。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)表明，對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較大的8個(gè)主要變量為蔗糖、乳糖、甘油、酵母膏、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4和CaCl2，再加3個(gè)虛擬變量，每個(gè)變量有高（+）、低（-）2個(gè)水平，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，共計(jì)12組試驗(yàn)（表2）。使用Design-Expert軟件對(duì)表2進(jìn)行分析，得到表3。由表3可知，上述8個(gè)因素對(duì)金龜子綠僵菌生物量的影響順序由大到小為：蔗糖、酵母膏、MgSO4、乳糖、蛋白胨、甘油、CaCl2、KH2PO4，其中蔗糖為極顯著因素。該模型R2=0.988 4，表示98.84%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以使用該模型進(jìn)行解釋。Prob>F值小于0.05表示該因素為顯著因素，從8個(gè)因素中選出對(duì)金龜子綠僵菌生長(zhǎng)顯著的因素（蔗糖、酵母膏、MgSO4），進(jìn)行下一步試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，蔗糖、酵母膏、MgSO4的模型方程系數(shù)為正值，進(jìn)行正爬坡。具體設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，選擇第5組試驗(yàn)方案時(shí)，即蔗糖20 g/L、酵母膏20 g/L、MgSO4 0.7 g/L，對(duì)應(yīng)的生物量達(dá)到最高值，以此值為中心值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，這樣響應(yīng)面方程才能充分逼近真實(shí)值。

2.2.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)和爬坡試驗(yàn)，確定蔗糖、酵母膏、MgSO4的水平，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)見表5、表6。根據(jù)表6的數(shù)據(jù)，使用 Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合，得到三元二次回歸方程：Y =-303.58+6.90A+6.79B+523.41C+0.03AB-1.16AC-141BC-0.16A2-0.16B2-338.12C2，其中：Y為菌體生物量，A、B、C分別為蔗糖、酵母膏、MgSO4濃度。根據(jù)表6的結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)其進(jìn)行方差分析和模型的顯著性分析，得到表7。由表7可知：該模型的P

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析

由二元回歸方程所得到的響應(yīng)面圖與相應(yīng)的等高線圖見圖4至圖6。各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值菌體生物量的影響由圖可以直觀地反映出來[8-10]。圖4表明，在MgSO4一定的情況下，蔗糖和酵母膏的交互作用顯著，隨著蔗糖和酵母膏含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。

由圖5可知，在酵母膏一定的情況下，隨著蔗糖和MgSO4含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在一定程度上，提高培養(yǎng)基中蔗糖和MgSO4的含量有利于提高菌體生物量，但蔗糖濃度過高會(huì)影響細(xì)胞通透性，抑制菌體生長(zhǎng)，不利于生物量的增加。

由圖6可知，在蔗糖一定的情況下，酵母膏和MgSO4交互作用較顯著，隨著酵母膏和MgSO4含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。

為求出培養(yǎng)基最佳配方，對(duì)回歸方程各個(gè)變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得：A=20.07，B=20.04，C=0.70，此時(shí)金龜子綠僵菌生物量達(dá)到16.173 g/L。同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，在最適發(fā)酵條件下，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，金龜子綠僵菌生物量實(shí)測(cè)值為16.523 g/L，與預(yù)測(cè)值基本符合。說明響應(yīng)面法對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化具有較強(qiáng)可靠性。因此，得到最佳培養(yǎng)基配方是：蔗糖20.07 g/L、酵母膏 20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)Plackett-Burman試驗(yàn)確定了蔗糖、酵母膏、MgSO4為主要影響因素，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行最

陡爬坡試驗(yàn)，確定最佳響應(yīng)面區(qū)域，然后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Design Expert 軟件分析計(jì)算，得到這3種因素的添加量：蔗糖20.07 g/L、酵母膏20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。經(jīng)過驗(yàn)

證在此發(fā)酵條件下金龜子綠僵菌生物量達(dá)到16.523 g/L，與原始發(fā)酵液的菌體生物量相比提高了37.24%，成本降低了約30%，有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。然而此研究?jī)H限于搖瓶發(fā)酵，很多因素（如溶氧、通氣量等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發(fā)酵，進(jìn)一步優(yōu)化影響金龜子綠僵菌發(fā)酵的條件。

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