焦展　安勝軍　邵鐵梅

摘要：以油葵為試材，用實生苗砧木和接穗進行嫁接試驗，比較斜接、插接、劈接和合接4種方法以及不同品種、苗齡的砧木、嫁接后綁縛方法的嫁接效果，并試驗離體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因接穗嫁接效果。結(jié)果表明，劈接法最為適宜，砧木選用在1對真葉期和2對真葉期的恢復系嫁接效果較好；嫁接后用棉線繩綁縛，濕報紙包裹，最后用嫁接夾固定，實生嫁接成活率可達80%以上。采用子葉節(jié)侵染和去1片子葉侵染2種轉(zhuǎn)基因方法，獲得轉(zhuǎn)基因陽性接穗經(jīng)壯苗培養(yǎng)后嫁接，得到完整植株的成活率可達60%和81.11%，明顯高于用生根移栽的方法和直接嫁接的方法，而且嫁接植株能夠正常開花結(jié)籽。從結(jié)果可以看出，劈接法為油葵最適宜的嫁接方法，可顯著提高離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究中獲得完整植株的概率，且能夠應(yīng)用于油葵基因工程育種研究中。

關(guān)鍵詞：油葵；嫁接；劈接法；離體培養(yǎng)；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號： S565.504.3；S339.4+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0143-04

嫁接技術(shù)是一門應(yīng)用廣泛的園藝技術(shù)，也是近年來基因工程育種研究領(lǐng)域的常用技術(shù)之一[1-2]。油葵即油用向日葵（Helianthus annuus L.），是我國乃至世界重要的油料作物。向日葵離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因方面的研究已有幾十年的歷程[3]。通過基因轉(zhuǎn)化將有益基因?qū)胱魑锸强共?、抗蟲和抗逆育種的有效手段，同時也是轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白不可缺少的重要基礎(chǔ)[4-6]。然而，多年來在向日葵離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，油葵離體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究中常遇到諸如離體生根困難，移栽成活率低，再生或轉(zhuǎn)化植株易早花敗育、結(jié)實困難等問題[7-8]。這些問題已成為該植物轉(zhuǎn)基因研究中獲得完整植株并繁育后代的嚴重障礙[3]。已有研究指出，利用嫁接可獲得完整轉(zhuǎn)基因植株[4，9-13]。但是關(guān)于油葵嫁接的具體技術(shù)方面的研究還未見報道。本試驗詳述了一種油葵嫁接新技術(shù)，可有效解決這一難題，為油葵離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因研究中獲得完整植株開辟了新的途徑。同時，該技術(shù)也適用于其他栽培研究方面，能夠為向日葵遠緣雜交、品種改良等研究提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本試驗以羅馬尼亞“精選”恢復系為試材，進行離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。在嫁接試驗中砧木選用羅馬尼亞“精選”恢復系（種子由河北省半干旱研究中心提供）和雜交種“矮大頭”（從種子公司購買），接穗選用 “精選”恢復系及其離體培養(yǎng)材料。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子萌發(fā)培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L 6-BA，去1片子葉離體培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L 6-BA。子葉節(jié)再生培養(yǎng)基MS+B5有機物+肌醇0.1 g/L+KNO3 5 g/L+水解酪蛋白0.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.07 mg/L+TIBA 0.02 mg/L+苯丙氨酸5.0 mg/L+AgNO3 7.0 mg/L。培養(yǎng)基中含蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8。

1.1.3 試劑 所用試劑購自上海生工公司；培養(yǎng)土為北京大漢公司培養(yǎng)土，與蛭石1 ∶ 1混合。

1.2 方法

1.2.1 油葵的離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因 油葵去1片子葉再生和轉(zhuǎn)化：油葵種子消毒后，放于培養(yǎng)基中萌發(fā)3～4 d，用解剖刀去掉1片子葉并劃傷生長點部位。將制備好的外植體放于預先制備好的農(nóng)桿菌（含有胰島素基因）懸菌液中浸泡0.5～1 h，共培養(yǎng)3 d。然后轉(zhuǎn)入含卡那霉素（Kan） 50 mg/L和頭孢霉素（Cef） 250 mg/L篩選培養(yǎng)基中篩選3周得到抗性芽，每周更換1次培養(yǎng)基。最后取葉片經(jīng)PCR檢測，結(jié)果為陽性的抗性芽用于嫁接。

油葵子葉節(jié)的離體再生和轉(zhuǎn)化：油葵種子消毒后，置于無菌瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)6 h（135 r/min，27 ℃）。在超凈工作臺上用解剖刀將種子2片子葉分開，適當去除1 mm左右胚軸，并確保去除生長點和幼芽，最后切除子葉遠離生長點的1/2部分，剩余部分作為離體再生的外植體。侵染方法同上。侵染后3 d轉(zhuǎn)入含Cef 250 mg/L的再生培養(yǎng)基中生長10 d，然后轉(zhuǎn)入含Kan 50 mg/L 和Cef 250 mg/L篩選培養(yǎng)基中篩選3周，每周更換1次培養(yǎng)基。最后將得到的抗性芽取葉片作PCR檢測，結(jié)果為陽性的用于嫁接。

轉(zhuǎn)基因方法由農(nóng)桿菌介導，使用的菌株為含有胰島素基因的LBA4404。PCR檢測所用引物序列為：上游引物5′-CGGGGTACCTCGTCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′；下游引物5′-CGAGCTCTTAGTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.2 接穗和砧木的選擇 接穗的準備方法：挑選健壯種子播種，待幼苗長至1對真葉時取上胚軸以上部位作為接穗供嫁接使用。離體培養(yǎng)的再生芽和轉(zhuǎn)基因試驗中的陽性芽也作為接穗使用。

砧木的準備方法：將油葵種子（品種為羅馬尼亞“精選”恢復系和雜交種“矮大頭）用濕播法播種于10 cm營養(yǎng)缽里，每穴1株。用子葉期至2對真葉期的幼苗在子葉節(jié)處、上胚軸處或1對真葉和2對真葉的莖節(jié)之間切去上半部位丟棄，余下部分作為砧木。

1.2.3 嫁接方法的比較 本試驗比較4種嫁接方法（圖1），砧木切割部位均為第1對真葉以上2.0～3.0 cm處，并將以上部位除去，4種嫁接方法分別為：（1）斜接法，挑選莖粗相近的接穗和砧木，在接穗的下端和砧木的上端均斜向削出 10 cm 左右等長的平整斜面，將兩斜面對接整齊。（2）插接法，取尖銳竹簽從砧木橫截面上插孔，將接穗下端削成適合砧木凹槽和深度的形狀，插入砧木孔中。（3）劈接法，用鋒利刀片于砧木莖中間豎直劈開1.0 cm左右的切口；在接穗下端削出兩面各1.0 cm長的斜面，將接穗插入切開的砧木，使二者的形成層部分對齊。（4）合接法[14]，自上而下將砧木的莖削成平滑的斜面，斜面長度為 1.0～1.5 cm，自斜面順莖中軸垂直將莖切開至斜面底部，切口深度0.5～1.0 cm。將接穗削成與砧木同樣大小的斜面并沿中軸垂直切開，刀口深度 0.5～1.0 cm。將砧木和接穗內(nèi)切面部位的莖相互交錯插至切面底部。統(tǒng)計嫁接后5、10 d成活率，每種嫁接方法試驗30株，重復3次。

1.2.4 砧木不同苗齡和不同品種的比較 砧木不同品種和苗齡的試驗采用6個處理，分別為子葉期恢復系、1對真葉期恢復系、2對真葉期恢復系、子葉期“矮大頭”、1對真葉期“矮大頭”和2對真葉期“矮大頭”。接穗均為恢復系實生植株的1對真葉期的頂芽。每處理30株，重復3次，嫁接后10 d統(tǒng)計成活率。

1.2.5 嫁接綁縛和嫁接后的管理 嫁接綁縛的4種方法相比較：（1）用棉線繩綁縛接口，并用保鮮膜保濕；（2）用濕報紙包裹接口并用嫁接夾固定；（3）用濕報紙包裹接口并用棉線繩綁縛固定；（4）用濕報紙包裹、棉線繩綁縛，最后用嫁接夾固定。每處理30株，重復3次。嫁接后，用保鮮袋覆蓋植株，并保證每天開袋透氣2次，每次10 min左右，并噴水保濕。5 d 后拆除綁縛和嫁接夾，但仍需注意保濕，循序漸進摘除保濕袋，7～10 d后檢查嫁接成活。14 d后將嫁接成活株移至大盆。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

嫁接后5～10 d觀察傷口愈合情況和生長狀態(tài)，統(tǒng)計嫁接苗成活率，計算平均值。數(shù)據(jù)用DPS進行統(tǒng)計分析，方法為鄧肯氏新復極差法，顯著水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫁接方法的嫁接效果

本試驗為更科學地比較4種嫁接方法的優(yōu)劣，用“精選”恢復系實生苗接穗進行嫁接試驗。嫁接后5 d成活率分別為：斜接法和劈接法成活率較高，分別為84.44%和88.89%，而插接法和合接法成活率較低，分別為60.00%和62.22%。而嫁接后10 d統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示劈接法成活率最高（82.22%），是油葵嫁接最理想的方法，其次為斜接法62.22%，而插接法和合接法成活率較低，分別為33.33%和37.78%（圖2）。通過與非嫁接苗的生長狀況進行比較，嫁接后10 d，嫁接苗長勢明顯偏弱，生長速度緩慢，但經(jīng)過20 d左右的生長，砧木和接穗結(jié)合良好后，嫁接苗會迅速生長，最終與非嫁接苗相比，莖肝略細，花盤略小，可正常結(jié)實，籽粒飽滿。

2.2 砧木品種和苗齡對嫁接的影響

本嫁接試驗用“精選”恢復系作為接穗，比較了同品種砧木和雜交種“矮大頭”2種砧木對嫁接的影響。結(jié)果表明，“精選”恢復系的嫁接成活率明顯高于“矮大頭”的嫁接成活

率，說明砧木“矮大頭”與接穗的親和力較差。而比較不同苗齡對嫁接的影響，1對真葉期和2對真葉期的恢復系砧木嫁接效果最好，成活率均高于80%，且兩者沒有顯著性差異。因此，本研究中其他試驗均選用1對至2對真葉期的恢復系實生苗作為嫁接砧木使用（圖3）。

2.3 綁縛方法對嫁接成活率的影響

試驗結(jié)果表明，用棉線繩綁縛并用保鮮膜保濕的方法在4種方法中成活率最低，僅為11.11%；而報紙保濕并用嫁接夾固定和報紙保濕用棉線繩固定2種方法的成活率沒有顯著性差異，分別為38.89%和42.22%；成活率最高的綁縛方法為，用棉線繩綁縛，然后用報紙保濕最后用嫁接夾再次固定。這種方法嫁接成活率顯著高于其他方法，成活率為84.44%（圖4）。

2.4 離體培養(yǎng)再生苗或轉(zhuǎn)基因苗的嫁接

2.4.1 離體培養(yǎng)再生芽或轉(zhuǎn)基因芽的獲得 侵染后的子葉節(jié)外植體3～5 d開始吸水膨脹，10 d左右可用肉眼觀察到在子葉節(jié)處有膨脹的芽點。多數(shù)情況下芽點出現(xiàn)在子葉節(jié)處，后期分化出再生芽。去1片子葉實生株經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，10 d 后也可見新的幼芽萌發(fā)。通過2種方法，并經(jīng)過3次抗生素篩選，均可得到抗性芽，PCR結(jié)果如圖5所示。將陽性芽作為接穗嫁接于砧木上，成活后即可初步得到完整的轉(zhuǎn)基因植株。

2.4.2 離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因芽的嫁接 預試驗研究中發(fā)現(xiàn)，通過子葉節(jié)和去1片子葉的轉(zhuǎn)化方法，獲得轉(zhuǎn)基因芽后進行生根移栽以期獲得完整植株，成活率相當?shù)停?0%和17.78%）。即使獲得完整植株，植株瘦弱，早花現(xiàn)象嚴重，幾乎不能獲得種子。依靠嫁接技術(shù)獲得完整植株，成活率可達40%和 56.67%。而嫁接前，對接穗進行壯苗培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)基因陽性芽移至不含Kan的培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中添加少量的PP333，培養(yǎng)7 d，然后開瓶鍛煉3 d。結(jié)果表明，經(jīng)壯苗培養(yǎng)的接穗嫁接成活率明顯高于直接嫁接的接穗，成活率可達60%和 81.11%（圖6）。

由子葉節(jié)和去1片子葉2種方法轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因芽，經(jīng)過壯苗培養(yǎng)和開瓶鍛煉，作為接穗，采用劈接法嫁接于實生苗砧木，10 d后接口愈合良好，20 d后莖稈變粗生長迅速，35 d 后可開花，最終能夠獲得種子（圖7）。

3 討論與結(jié)論

本試驗系統(tǒng)研究了油葵嫁接技術(shù)，并將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究中獲得了完整的轉(zhuǎn)基因植株，并能夠開花結(jié)籽。嫁接技術(shù)能夠提高離體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因苗的成活率，這和前人研究結(jié)果[15-16]一致。研究結(jié)果顯示，劈接法為油葵最適宜的嫁接方法。這與王彥霞等、吳慎杰等在棉花上的結(jié)果[14，16]不同。原因可能與植物本身生長特性和生理狀態(tài)相關(guān)。棉花幼苗的莖

較粗較硬，而油葵幼苗的莖較為纖細柔嫩，因此，適宜棉花的合接法對于油葵來說，操作不便，操作過程過長會造成莖的失水萎蔫，不利于接口愈合。而劈接法操作簡便，且更為直觀，容易使接口形成層對準，因而更利于接口愈合[17-18]。但有研究指出，嫁接成活后砧木和接穗可能會相互影響，還有可能發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[1，19-20]，本研究未做探討，有待進一步深入研究。

需要注意的是，在嫁接傷口愈合前，砧木和接穗都靠自身的養(yǎng)分積累提供營養(yǎng)物質(zhì)[1，19]。因此，砧木和接穗在嫁接前需要去除多余的葉片，以減少養(yǎng)分的消耗。研究中比較了4種不同的嫁接后綁縛方式。棉線繩、保鮮膜和嫁接夾都具有一定的固定功能，保鮮膜和報紙則用來對接口進行保濕。保鮮膜保濕效果較好，但容易造成接口處通氣不良，接口易壞死。而棉線繩綁縛并用濕報紙保濕，既能起到良好地固定作用使接口較好的接合，又能使接口處于濕潤狀態(tài)，由于每天噴水并開袋透氣，所以保濕效果良好，接口愈合快。另外，嫁接夾不可過緊，否則影響接口養(yǎng)分運輸，造成結(jié)合不良。嫁接時可將嫁接夾的環(huán)放松一點，以能夠固定嫁接綁縛物并且莖稈接口處不變形為準，可達到良好的效果。

該嫁接技術(shù)可顯著提高離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究中獲得完整植株的概率，且嫁接后的轉(zhuǎn)基因植株能夠正常開花結(jié)實。該方法可應(yīng)用于油葵基因工程育種研究中。

參考文獻：

[1]Wang Y Q. Plant grafting and its application in biological research[J]. Chinese Science Bulletin，2011，56（33）：3511-3517.

[2]Cervera M，Navarro A，Navarro L，et al. Production of transgenic adult plants from Clementine Mandarin by enhancing cell competence for transformation and regeneration[J]. Tree Physiology，2008，28（1）：55-66.

[3]劉海臣. 向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 長春：長春理工大學，2006.

[4]Sawahel W，Hagran A. Generation of white mold disease-resistant sunflower plants expressing human lysozyme gene[J]. Biologia Plantarum，2006，50（4）：683-687.

[5]Neskorodov Y B，Rakitin A L，Kamionskaya A M，et al. Developing phosphinothricin-resistant transgenic sunflower （Helianthus annuus L.） plants[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，100（1）：65-71.

[6]司立平，李聯(lián)社，吳燕民. 向日葵基因工程研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2012，14（6）：62-69.

[7]劉海學，王 罡，季 靜. 向日葵組織培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J]. 中國油料作物學報，2005，27（4）：95-99.

[8]景 嵐，沙日娜. 向日葵組織培養(yǎng)研究進展[J]. 西北植物學報，2007，27（1）：201-205.

[9]Knittel N，Gruber V，Hahne G，et al. Transformation of sunflower （Helianthus annuus L.）：a reliable protocol[J]. Plant Cell Reports，1994，14（2/3）：81-86.

[10]Molinier J，Thomas C，Brignou M，et al. Transient expression of ipt gene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices （Helianthus annuus L.）[J]. Plant Cell Reports，2002，21（3）：251-256.

[11]Rousselin P，Molinier J，Himber C，et al. Modification of sunflower oil quality by seed-specific expression of a heterologous Δ9-stearoyl-（acyl carrier protein）desaturase gene[J]. Plant Breeding，2002，121（2）：108-116.

[12]Grayburn W S，Vick B A. Transformation of sunflower （Helianthus annuus L.） following wounding with glass beads[J]. Plant Cell Reports，1995，14（5）：285-289.

[13]Lucas O，Kallerhoff J，Alibert G. Production of stable transgenic sunflowers （Helianthus annuus L.） from wounded immature embryos by particle bombardment and co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens[J]. Molecular Breeding，2000，6（5）：479-487.

[14]王彥霞，王省芬，馬峙英，等. 棉花高效嫁接新方法及其應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40（2）：264-270.

[15]李長生，夏 晗，盧金東，等. 利用嫁接提高花生離體再生或轉(zhuǎn)基因苗成活率的研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2009，25（20）：63-67.

[16]吳慎杰，李飛飛，張?zhí)煺? 插皮接技術(shù)在棉花再生植株嫁接中的應(yīng)用[J]. 棉花學報，2006，18（6）：347-351.

[17]盧昱宇，馮偉民，陳 罡，等. 蔬菜嫁接技術(shù)研究進展及應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（7）：167-169.

[18]孫海麗，趙智勇，李秀菊.對植物遠緣嫁接中幾個問題的探討[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（11）：9-13.

[19]朱高浦，李芳東，杜紅巖，等. 植物嫁接技術(shù)機理研究進展[J]. 熱帶作物學報，2012，33（5）：962-967.

[20]郭傳友，黃堅欽，方炎明. 植物嫁接機理研究綜述[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報，2004，26（1）：144-148.