楊華　李亞春　毛從亞

摘要：新的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》于2014年6月1日實施，筆者所在實驗室依據(jù)新的標(biāo)準(zhǔn)建立了新的水稻品種真實性鑒定體系。將2個水稻樣品（編號為A、B）與其標(biāo)注的品種名稱相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號：SD20140244）進(jìn)行了比對，結(jié)果表明，樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品無位點差異，判定為近似品種；樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品有6個位點差異，判定為不同品種。

關(guān)鍵詞：水稻；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；品種真實性鑒定

中圖分類號： S511.037 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0087-03

水稻品種真實性鑒定即鑒定一份種子樣品與所屬的品種、種或文件描述是否相符。最初一般采取田間種植鑒定的方法對品種真實性進(jìn)行鑒定，但是由于此方法周期長，有時鑒定結(jié)果出來后種子銷售已經(jīng)結(jié)束，不能滿足種子市場管理機(jī)構(gòu)快速、準(zhǔn)確鑒定種子真實性的新要求。另外由于江蘇省以常規(guī)水稻為主，部分品種親緣關(guān)系比較近，田間種植表型差異很小，甚至基本無表型差異，給鑒定工作造成了困擾。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)尤其是SSR分子標(biāo)記技術(shù)在品種真實性鑒定工作中被廣泛應(yīng)用[1-4]。SSR分子標(biāo)記具有非組織和發(fā)育階段特異性、不容易受外界環(huán)境影響、多態(tài)性高、在基因組中分布廣泛、呈共線性遺傳等優(yōu)點[5-7]。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測品種真實性的方法快速、簡便且重演性高。2007年，國家出臺了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2007《水稻品種鑒定：DNA指紋方法》，一直以來，種子檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行水稻品種真實性鑒定工作時都是以此標(biāo)準(zhǔn)作為檢測和結(jié)果判定的依據(jù)。2014年，農(nóng)業(yè)部在深入研究和廣泛征求基層單位意見的基礎(chǔ)上更新了此標(biāo)準(zhǔn)，出臺了新的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014 《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法 》。本檢驗室依據(jù)新的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建立起新的水稻品種真實性鑒定體系，并進(jìn)行了大量的檢驗工作對新體系進(jìn)行驗證。本研究以2個水稻樣品（編號為A、B）與其標(biāo)注的品種名稱相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號：SD20140244）比對為例，說明此方法的可操作性和適用性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品

選取保存在江蘇省農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗中心標(biāo)準(zhǔn)樣品庫中編號為SD20140244的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2 待測樣品

2個待測樣品分別來自市場抽檢中標(biāo)簽標(biāo)注與編號為SD20140244的標(biāo)準(zhǔn)樣品品種名稱相同的樣品，編號為A、B。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 本試驗采用水稻干種子直接提取方法，樣品經(jīng)SPEX Geno 2010 高通量冷凍研磨機(jī)磨碎后，用Omega公司的植物基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit D3485-01）提取水稻全基因組DNA，詳細(xì)方法見試劑盒說明書。用微量紫外分光光度計（Thermo Scientific ND2000）檢測DNA質(zhì)量濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的48對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司 PER001-2型號Taq酶混合物作為反應(yīng)體系。反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性2 min；進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）；72 ℃下延伸8 min；10 ℃恒溫冷卻。

1.3.3 電泳及染色 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》中規(guī)定的非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和染色方法。染色結(jié)束后用Bio-RAD公司的Gel Dox XR+型號凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像，并用Image lab 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

鑒于之前標(biāo)準(zhǔn)中需要先發(fā)芽再提取DNA的周期太長，近1周時間，本研究直接采用干種子磨碎DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行提取，每個樣品只需1.5 h就能提取到水稻全基因組DNA，提取的DNA經(jīng)過檢測質(zhì)量較高（表1），完全符合PCR擴(kuò)增的需要，極大提高了檢測效率。

2.2 PCR反應(yīng)優(yōu)化

新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的48對引物最適合的退火溫度不同，為50～67 ℃，為最大限度地將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品放于同一PCR板中進(jìn)行檢測，經(jīng)過不同溫度試驗，選取58 ℃為退火溫度，在此溫度下48對引物均能得到特異性比較好的目的條帶（圖1、圖2）。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析

依據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)中的電泳方法、染色方法，2組比對試驗均得到了較為清楚的指紋圖譜。清晰的指紋圖譜是分析、判定結(jié)果的重要前提，不同的實驗室應(yīng)根據(jù)自己的情況選擇合適的藥品和設(shè)備進(jìn)行試驗，以得到特異性條帶清楚、背景干凈的圖譜，才能進(jìn)行接下來的數(shù)據(jù)分析。指紋圖譜經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像后，導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行分析，分別標(biāo)記泳道和條帶，計算條帶大小。按照新標(biāo)準(zhǔn)中的數(shù)據(jù)記錄方式記錄條帶信息。純合位點的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大?。浑s合位點的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上2個不同等位變異。小片段在前，大片段在后。缺失位點記錄為0/0。此種記錄方法的優(yōu)點是不僅能夠反映待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的差異，還能反映位點的基因型及變異的大小，將數(shù)據(jù)記錄的結(jié)果統(tǒng)一，也便于后期指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和不同實驗室之間標(biāo)準(zhǔn)樣品信息的共享（表2）。

2.4 SSR標(biāo)記法鑒定水稻品種真實性結(jié)果判定

新標(biāo)準(zhǔn)對于結(jié)果判定也進(jìn)行了規(guī)定，當(dāng)樣品間差異位 點≥2，則判定為“不同品種”；當(dāng)樣品間差異位點=1，則判定為“近似品種”；當(dāng)樣品間差異位點=0，則判定為“極近似品種或相同品種”。從表2可以看出，樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品之間無差異位點，即差異位點=1，所以判定樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品為相同品種；樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品在引物（B02、B06、B11、C02、C09、C11）擴(kuò)增出的基因位點上存在差異，即樣品間差異位點為6，判定樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品為“不同品種”。

3 結(jié)論與討論

江蘇省是種業(yè)大省，同時也是中國水稻主產(chǎn)省和高產(chǎn)省之一，素有“魚米之鄉(xiāng)”之稱，從事農(nóng)作物品種選育的科研單位40余家，目前為止通過江蘇省審定的水稻品種有213個，通過國家審定的有78個，品種眾多[8]。正是因為品種多、品種雜以及從事水稻生產(chǎn)銷售的主體多，使得種子市場上制售假劣種子、套牌侵權(quán)、未審先推等問題屢屢出現(xiàn)，在社會上引起了廣泛關(guān)注，嚴(yán)重?fù)p害了農(nóng)民和品種權(quán)人權(quán)益，阻礙了現(xiàn)代種業(yè)可持續(xù)發(fā)展。這就要求從事相關(guān)種子檢測工作的檢驗中心具備有據(jù)可依、快速、準(zhǔn)確的品種真實性鑒定手段。2014年實施的農(nóng)業(yè)行業(yè)新標(biāo)準(zhǔn)在試驗方法、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計、結(jié)果判定等方面都進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，并且將原來的24對引物保留了19對，新增了29對引物，最終確定了48對引物；此外還增加了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測等新的檢測平臺。新標(biāo)準(zhǔn)的實施為水稻品種真實性鑒定室內(nèi)分子檢測方法提供了判定依據(jù)，新標(biāo)準(zhǔn)檢測體系也能為農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門開展執(zhí)法工作以及種子市場監(jiān)管工作提供相應(yīng)的技術(shù)支撐，減少假劣種子進(jìn)入市場的概率，促進(jìn)江蘇省種業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王 飛. SSR分子標(biāo)記在棉種真實性和純度中的應(yīng)用研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[2]王鳳格，趙久然，戴景瑞，等. 利用SSR標(biāo)記進(jìn)行玉米品種一致性檢測研究[J]. 分子植物育種，2007，5（1）：95-104.

[3]周 會，蘇 秀，毛雙林，等. 雜交水稻品種真實性和純度的SSR分子標(biāo)記鑒定[J]. 種子世界，2014（3）：34-35.

[4]張冰清，陸徐忠，吳新杰，等. 利用SSR標(biāo)記進(jìn)行雜交油菜品種鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報，2014，36（6）：728-734.

[5]羅 冉，吳委林，張 旸，等. SSR分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（1）：137-143.

[6]羅 兵，孫海燕，徐港明，等. SSR分子標(biāo)記研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（12）：5210-5212，5246.

[7]楊文柱，焦 燕.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在生物遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：640-642.

[8]殷錢茜，殷海軍.江蘇水稻種子產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、問題及發(fā)展對策[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：515-519.