楊華　李亞春　毛從亞

摘要：新的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》于2014年6月1日實(shí)施，筆者所在實(shí)驗(yàn)室依據(jù)新的標(biāo)準(zhǔn)建立了新的水稻品種真實(shí)性鑒定體系。將2個(gè)水稻樣品（編號(hào)為A、B）與其標(biāo)注的品種名稱相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：SD20140244）進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果表明，樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品無位點(diǎn)差異，判定為近似品種；樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品有6個(gè)位點(diǎn)差異，判定為不同品種。

關(guān)鍵詞：水稻；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；品種真實(shí)性鑒定

中圖分類號(hào)： S511.037 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0087-03

水稻品種真實(shí)性鑒定即鑒定一份種子樣品與所屬的品種、種或文件描述是否相符。最初一般采取田間種植鑒定的方法對(duì)品種真實(shí)性進(jìn)行鑒定，但是由于此方法周期長(zhǎng)，有時(shí)鑒定結(jié)果出來后種子銷售已經(jīng)結(jié)束，不能滿足種子市場(chǎng)管理機(jī)構(gòu)快速、準(zhǔn)確鑒定種子真實(shí)性的新要求。另外由于江蘇省以常規(guī)水稻為主，部分品種親緣關(guān)系比較近，田間種植表型差異很小，甚至基本無表型差異，給鑒定工作造成了困擾。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)尤其是SSR分子標(biāo)記技術(shù)在品種真實(shí)性鑒定工作中被廣泛應(yīng)用[1-4]。SSR分子標(biāo)記具有非組織和發(fā)育階段特異性、不容易受外界環(huán)境影響、多態(tài)性高、在基因組中分布廣泛、呈共線性遺傳等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)品種真實(shí)性的方法快速、簡(jiǎn)便且重演性高。2007年，國(guó)家出臺(tái)了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2007《水稻品種鑒定：DNA指紋方法》，一直以來，種子檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行水稻品種真實(shí)性鑒定工作時(shí)都是以此標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)和結(jié)果判定的依據(jù)。2014年，農(nóng)業(yè)部在深入研究和廣泛征求基層單位意見的基礎(chǔ)上更新了此標(biāo)準(zhǔn)，出臺(tái)了新的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433—2014 《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法 》。本檢驗(yàn)室依據(jù)新的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)建立起新的水稻品種真實(shí)性鑒定體系，并進(jìn)行了大量的檢驗(yàn)工作對(duì)新體系進(jìn)行驗(yàn)證。本研究以2個(gè)水稻樣品（編號(hào)為A、B）與其標(biāo)注的品種名稱相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)：SD20140244）比對(duì)為例，說明此方法的可操作性和適用性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品

選取保存在江蘇省農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)樣品庫中編號(hào)為SD20140244的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2 待測(cè)樣品

2個(gè)待測(cè)樣品分別來自市場(chǎng)抽檢中標(biāo)簽標(biāo)注與編號(hào)為SD20140244的標(biāo)準(zhǔn)樣品品種名稱相同的樣品，編號(hào)為A、B。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 本試驗(yàn)采用水稻干種子直接提取方法，樣品經(jīng)SPEX Geno 2010 高通量冷凍研磨機(jī)磨碎后，用Omega公司的植物基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit D3485-01）提取水稻全基因組DNA，詳細(xì)方法見試劑盒說明書。用微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific ND2000）檢測(cè)DNA質(zhì)量濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的48對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司 PER001-2型號(hào)Taq酶混合物作為反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性2 min；進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）；72 ℃下延伸8 min；10 ℃恒溫冷卻。

1.3.3 電泳及染色 采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標(biāo)記法》中規(guī)定的非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和染色方法。染色結(jié)束后用Bio-RAD公司的Gel Dox XR+型號(hào)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描成像，并用Image lab 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

鑒于之前標(biāo)準(zhǔn)中需要先發(fā)芽再提取DNA的周期太長(zhǎng)，近1周時(shí)間，本研究直接采用干種子磨碎DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行提取，每個(gè)樣品只需1.5 h就能提取到水稻全基因組DNA，提取的DNA經(jīng)過檢測(cè)質(zhì)量較高（表1），完全符合PCR擴(kuò)增的需要，極大提高了檢測(cè)效率。

2.2 PCR反應(yīng)優(yōu)化

新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的48對(duì)引物最適合的退火溫度不同，為50～67 ℃，為最大限度地將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品放于同一PCR板中進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過不同溫度試驗(yàn)，選取58 ℃為退火溫度，在此溫度下48對(duì)引物均能得到特異性比較好的目的條帶（圖1、圖2）。

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析

依據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)中的電泳方法、染色方法，2組比對(duì)試驗(yàn)均得到了較為清楚的指紋圖譜。清晰的指紋圖譜是分析、判定結(jié)果的重要前提，不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的情況選擇合適的藥品和設(shè)備進(jìn)行試驗(yàn)，以得到特異性條帶清楚、背景干凈的圖譜，才能進(jìn)行接下來的數(shù)據(jù)分析。指紋圖譜經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像后，導(dǎo)入分析軟件進(jìn)行分析，分別標(biāo)記泳道和條帶，計(jì)算條帶大小。按照新標(biāo)準(zhǔn)中的數(shù)據(jù)記錄方式記錄條帶信息。純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該位點(diǎn)等位變異的大?。浑s合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)上2個(gè)不同等位變異。小片段在前，大片段在后。缺失位點(diǎn)記錄為0/0。此種記錄方法的優(yōu)點(diǎn)是不僅能夠反映待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的差異，還能反映位點(diǎn)的基因型及變異的大小，將數(shù)據(jù)記錄的結(jié)果統(tǒng)一，也便于后期指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和不同實(shí)驗(yàn)室之間標(biāo)準(zhǔn)樣品信息的共享（表2）。

2.4 SSR標(biāo)記法鑒定水稻品種真實(shí)性結(jié)果判定

新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于結(jié)果判定也進(jìn)行了規(guī)定，當(dāng)樣品間差異位 點(diǎn)≥2，則判定為“不同品種”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)=1，則判定為“近似品種”；當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)=0，則判定為“極近似品種或相同品種”。從表2可以看出，樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品之間無差異位點(diǎn)，即差異位點(diǎn)=1，所以判定樣品A與標(biāo)準(zhǔn)樣品為相同品種；樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品在引物（B02、B06、B11、C02、C09、C11）擴(kuò)增出的基因位點(diǎn)上存在差異，即樣品間差異位點(diǎn)為6，判定樣品B與標(biāo)準(zhǔn)樣品為“不同品種”。

3 結(jié)論與討論

江蘇省是種業(yè)大省，同時(shí)也是中國(guó)水稻主產(chǎn)省和高產(chǎn)省之一，素有“魚米之鄉(xiāng)”之稱，從事農(nóng)作物品種選育的科研單位40余家，目前為止通過江蘇省審定的水稻品種有213個(gè)，通過國(guó)家審定的有78個(gè)，品種眾多[8]。正是因?yàn)槠贩N多、品種雜以及從事水稻生產(chǎn)銷售的主體多，使得種子市場(chǎng)上制售假劣種子、套牌侵權(quán)、未審先推等問題屢屢出現(xiàn)，在社會(huì)上引起了廣泛關(guān)注，嚴(yán)重?fù)p害了農(nóng)民和品種權(quán)人權(quán)益，阻礙了現(xiàn)代種業(yè)可持續(xù)發(fā)展。這就要求從事相關(guān)種子檢測(cè)工作的檢驗(yàn)中心具備有據(jù)可依、快速、準(zhǔn)確的品種真實(shí)性鑒定手段。2014年實(shí)施的農(nóng)業(yè)行業(yè)新標(biāo)準(zhǔn)在試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)、結(jié)果判定等方面都進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，并且將原來的24對(duì)引物保留了19對(duì)，新增了29對(duì)引物，最終確定了48對(duì)引物；此外還增加了變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)等新的檢測(cè)平臺(tái)。新標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施為水稻品種真實(shí)性鑒定室內(nèi)分子檢測(cè)方法提供了判定依據(jù)，新標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系也能為農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門開展執(zhí)法工作以及種子市場(chǎng)監(jiān)管工作提供相應(yīng)的技術(shù)支撐，減少假劣種子進(jìn)入市場(chǎng)的概率，促進(jìn)江蘇省種業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展。

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