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        遼寧省慢生根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性

        2016-10-20 01:31:14張艷華王惠王巖
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期

        張艷華 王惠 王巖

        摘要:花生是重要的豆科經(jīng)濟(jì)作物,能與慢生根瘤菌屬的根瘤菌共生固氮,遼寧省的花生種植較廣泛,但是對(duì)該地區(qū)花生根瘤菌的研究并不全面。采用16S rDNA和nifH基因的序列分析方法從遺傳學(xué)角度對(duì)17株分離自遼寧省不同地區(qū)的花生根瘤菌的特性進(jìn)行研究。根據(jù)16S rDNA基因的序列分析將所有菌株分為4個(gè)類群,而nifH基因的序列分析方法將供試菌株分成兩大類群,2種方法的分類結(jié)果大體一致,測(cè)序結(jié)果表明所有菌株都屬于慢生根瘤菌屬。說明遼寧省花生慢生根瘤菌的分布可能與該地的地理環(huán)境存在一定的相關(guān)性。

        關(guān)鍵詞:花生;慢生根瘤菌;系統(tǒng)發(fā)育多樣性

        中圖分類號(hào): S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)07-0067-04

        根瘤菌是能與豆科植物的根部組織建立共生固氮系統(tǒng)的土壤微生物,通過此共生固氮系統(tǒng)固定的氮素量對(duì)于陸地生態(tài)系統(tǒng)來說非常重要[1-2],而且有利于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和退化土地復(fù)墾的可持續(xù)發(fā)展[3]。通常認(rèn)為,共生根瘤菌分布于α-變形菌門的根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬、異根瘤菌屬和固氮根瘤菌屬[4],但是隨著根瘤菌分類學(xué)的發(fā)展,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些屬于β-變形菌門的根瘤菌,例如伯克氏菌屬和貪銅菌屬的微生物[5]。

        花生(Arachis hypogaea L.)別稱落花生,是一種重要的農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)豆科作物,可被用作糧食作物、油料作物和用于生產(chǎn)多種食品,通常認(rèn)為可與慢生根瘤菌共生進(jìn)行固氮,其耐旱性、固氮能力和耐陰性使其成為與玉米、高粱、谷子和其他禾本科作物進(jìn)行間作的重要豆科植物[6]。我國(guó)是世界上花生的進(jìn)出口大國(guó),花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)于增加農(nóng)民收入、促進(jìn)國(guó)內(nèi)食品安全發(fā)展和改善人們生活水平有重要的意義。

        共生固氮效力是衡量花生與本土根瘤菌共生系統(tǒng)的重要因素。在花生種植上接種根瘤菌有很好的固氮效果,然而固氮效果受所接種根瘤菌與本土根瘤菌間的競(jìng)爭(zhēng)影響很大[7],因此,從本地篩選出具有結(jié)瘤、固氮和高效競(jìng)爭(zhēng)能力的根瘤菌菌株非常重要[8]。然而,盡管花生在遼寧省種植較廣泛,但是關(guān)于本地根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性的相關(guān)報(bào)道并不多,本研究的目的在于通過對(duì)16S rDNA和nifH基因序列差異性分析,對(duì)本地花生根瘤菌的特性、種群和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究,評(píng)估地理變異,有助于改善豆科作物接種根瘤菌、提高固氮量的策略[9-10]。

        1 材料與方法

        1.1 菌株的采集

        本研究所用菌株的來源和地理環(huán)境列在表1中。所選菌株直接分離自遼寧省不同地理區(qū)域所種植的花生根瘤中,每株植物上隨機(jī)采集1~2個(gè)紅色根瘤,從根瘤中分離細(xì)菌的方法如下:根瘤用95%乙醇表面消毒30 s,隨即在0.1% HgCl2溶液中浸泡3~5 min,然后用無菌蒸餾水洗滌5~6次,夾破根瘤并在含有剛果紅的酵母浸出物-甘露醇培養(yǎng)基(YMA)平板上劃線[11],將平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)2~7 d長(zhǎng)出單菌落,隨后挑取長(zhǎng)出的分離物,經(jīng)過稀釋涂布平皿純化,挑取單菌落,-80 ℃冰凍保存在含有20%甘油的YMA液體培養(yǎng)基中[7]。根據(jù)菌株較慢的生長(zhǎng)速度和在含有溴麝香草酚藍(lán)(BTB)的YMA平板上產(chǎn)堿(培養(yǎng)基由草綠色變?yōu)樗{(lán)色)初步推斷屬于慢生根瘤菌屬[12]。通過結(jié)瘤試驗(yàn)驗(yàn)證菌株是否具有使花生結(jié)瘤的能力。

        1.2 結(jié)瘤試驗(yàn)

        對(duì)所有供試菌株包括從中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所獲得的參照菌株(慢生根瘤菌屬的1 024菌株)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盆栽結(jié)瘤試驗(yàn)?;ㄉN子表面消毒的方法與前面根瘤表面消毒的方法相同[11],置于含有濕潤(rùn)紗布的無菌平板中在28 ℃條件下催芽,待胚芽長(zhǎng)到約2.0 cm時(shí),播種到裝有蛭石和無氮營(yíng)養(yǎng)液并在121 ℃下滅菌1 h的玻璃罐中,每罐播種2粒,并在根部接種1 mL供試菌的菌懸液(約0.1億個(gè)細(xì)胞/mL),每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)并設(shè)置空白對(duì)照。將盆栽置于特定的環(huán)境下培養(yǎng)(28 ℃,每天光照16 h,相對(duì)濕度50%),適當(dāng)補(bǔ)澆無菌水,每月澆2次無氮營(yíng)養(yǎng)液[11]。接種45 d后收獲植株,記錄每個(gè)處理的結(jié)瘤數(shù)。內(nèi)部呈現(xiàn)紅色的根瘤視為有效根瘤。

        1.3 DNA提取

        提取DNA前,將供試菌株在YMA平板上劃線活化,28 ℃ 培養(yǎng)至長(zhǎng)成單菌落,挑取單菌落接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(0.4<0.6)用于提取總DNA,用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN,北京)提取DNA。

        1.4 PCR擴(kuò)增和16S rDNA基因序列測(cè)定

        選取每一樣地的代表菌株,DNA提取后,用引物fD1(5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和rD1(5′-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)擴(kuò)增16S rDNA基因。PCR程序按照Weisburg等的方法[9]操作,在1%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行PCR產(chǎn)物效果檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)拍照,效果較好的產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

        1.5 PCR擴(kuò)增和nifH基因序列測(cè)定

        由于nifH基因編碼固氮還原酶,為了研究根瘤菌的共生特性,筆者分析了nifH基因,用特異性引物nifHF(5′-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′)和nifHR(5′-AGCATGTCYTCSAGYTCNT CCA-3′)擴(kuò)增nifH基因,PCR程序參考Gurkanli等的研究[13]。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)拍照,送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

        1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

        通過NCBI上的BLAST工具進(jìn)行菌株的同源性分析,在BLAST數(shù)據(jù)庫獲取相似序列以及慢生根瘤菌屬參比菌株的基因序列,用MEGA 4.0軟件的CLUSTAL W功能進(jìn)行相似性比對(duì)[14],序列比對(duì)后,用MEGA 4.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。發(fā)育樹的自展檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)序列隨機(jī)選取500個(gè)重復(fù)來評(píng)估發(fā)育樹拓?fù)鋵W(xué)的可靠性,用Kimura 2-Parameter模型(K2P)來計(jì)算基因間距離。

        1.7 核苷酸序列入庫編號(hào)

        12個(gè)菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列和17個(gè)菌株的nifH基因的核苷酸序列存放在GenBank中,序列編號(hào)分別為KR092316-KR092327和KR092328-KR092344。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株的生長(zhǎng)性能

        本研究中的所有供試菌株都能使花生結(jié)瘤,初步證明這些菌株都屬于根瘤菌。28 ℃條件下,供試菌株在YMA平板上長(zhǎng)出單菌落約需要1周的時(shí)間,菌落呈乳白色,不透明或半透明,邊緣光滑,所有菌株因產(chǎn)生堿性物質(zhì)而使含有BTB的YMA培養(yǎng)基平板由草綠色變?yōu)樗{(lán)色(圖1)。這一結(jié)果進(jìn)一步表明供試菌株屬于慢生根瘤菌屬。

        2.2 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

        每個(gè)供試菌株的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增后都產(chǎn)生約145 kb的單一條帶。對(duì)從不同地區(qū)采集的12株代表菌株的16S rDNA序列的BLAST進(jìn)行分析,結(jié)果表明它們都屬于慢生根瘤菌屬,與Bradyrhizobium japonicum有最大的相似性。

        根據(jù)遼寧省本土花生慢生根瘤菌16S rDNA基因序列所做的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。與最相近的參考菌株有至少97%的序列相似性作為菌株分群的標(biāo)準(zhǔn),在16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析中,所有菌株被分為4個(gè)類群,不同地區(qū)菌株的區(qū)別顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖2)。所分成的4個(gè)類群都與B. japonicum有較高的序列相似性,F(xiàn)3屬于類群Ⅰ,它分離自遼寧省的北部,與B. japonicum USDA6最相近,相似性達(dá)到99%;C1、F2、F4和O屬于類群Ⅱ,它們分離自遼寧省的北部和中部。菌株B2、H4、G2、J1、J3和4被歸為類群Ⅲ,除了H4

        分離自遼寧省的北部,其余的都是在遼寧省的西部地區(qū)采集的;僅P2菌株歸為類群Ⅳ,它分離自遼寧省的西部。由于采集自同一地區(qū)的菌株樣本有被歸到不同類群的現(xiàn)象,16S rDNA類型與地理位置的相關(guān)性不太明顯,但仍然有一定的相關(guān)性。

        2.3 nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

        每一菌株的nifH基因PCR產(chǎn)物均產(chǎn)生約0.75 kb的單一條帶。對(duì)17株菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST,都顯示與慢生根瘤菌屬的菌株有較高的同源性。根據(jù)遼寧省本土花生慢生根瘤菌nifH基因序列測(cè)定結(jié)果所進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖3。以與最近的參考菌株有不少于97%的序列相似性作為菌株分群的標(biāo)準(zhǔn),系統(tǒng)發(fā)育樹可分為兩大類群,都屬于B. japonicum,與B. japonicum USDA110有至少97%的序列相似性,每一類群與相應(yīng)地理區(qū)域大致對(duì)應(yīng)。類群A的菌株包括P2、H4、4、F3、F4、01、F1、F2、C1,屬于北部和中部氣候區(qū),類群B菌株包括B3、B4、B1、B2、E1、J1、G2、J3,分離自西部和中部地區(qū)。與16S rDNA基因序列分析相比,nifH基因的共生基因類群A對(duì)應(yīng)16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ,nifH基因類群B與 16S rDNA 基因類群Ⅲ相對(duì)應(yīng),都屬于B. japonicum。

        3 結(jié)論與討論

        在本研究中,從遼寧省不同地區(qū)的花生種植區(qū)分離出17株根瘤菌,依據(jù)回接結(jié)瘤能力、在含有BTB的YMA平板上產(chǎn)生堿性物質(zhì)的能力、16S rDNA和nifH基因序列分析的結(jié)果,這些菌株都被歸為慢生根瘤菌屬。16S rDNA基因和管家基因常被用作分子系統(tǒng)學(xué)分類和評(píng)估慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的的標(biāo)記。本研究中,通過16S rDNA和nifH基因序列分析證明17株菌株都屬于B. japonicum,即B. japonicum是遼寧省慢生根瘤菌的優(yōu)勢(shì)種。遼寧省的地勢(shì)北部高,南部地,從陸地向海洋傾斜,可以大致的分為3個(gè)地理區(qū)域:西部高地、中部平原、東部丘陵。因此,地勢(shì)的差異可能影響本土根瘤菌的分布,在本研究中,依據(jù)16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,供試菌株被分為4個(gè)類群,所有類群都與B. japonicum有較高的序列相似性,而依據(jù)nifH基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試菌株分類兩大類,在這2種系統(tǒng)發(fā)育樹間有較大的相似性,與16S rDNA基因序列分析相比,nifH基因的共生基因類群A對(duì)應(yīng)16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ,nifH基因類群B與16S rDNA基因類群Ⅲ相對(duì)應(yīng),從每一類群中菌株的分布可以推測(cè)地理因素與本土根瘤菌的分布有一定的相關(guān)性。

        然而,由于每一樣地取樣量相對(duì)較小,降低了供試菌株的數(shù)量,可能低估了遼寧本地慢生根瘤菌的生物多樣性。盡管有些研究報(bào)道了有快生根瘤菌使花生結(jié)瘤的現(xiàn)象[16-17],但與花生共生結(jié)瘤的菌株大部分都屬于慢生根瘤菌[18-20],在本研究中,從花生根瘤中只分離出慢生根瘤菌,并未見快生菌結(jié)瘤的現(xiàn)象。

        有研究顯示,根瘤菌的分布、多樣性和本土性受土壤類型和氣候環(huán)境影響[11,21-22]。在對(duì)大豆所作的研究中,溫度和土壤pH值與尼泊爾地區(qū)根瘤菌種水平的分布有很大的相關(guān)性[10]。Dinesh等也報(bào)道了尼泊爾地區(qū)不同地理環(huán)境豇豆根瘤菌的分布多樣性[23]。

        總之,盡管本研究中供試菌株的多樣性并不高,但是也對(duì)遼寧省不同地理區(qū)域本土花生慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行的初步分析。結(jié)果顯示,遼寧省花生慢生根瘤菌可能依賴于地理位置而分布,這也暗示本土慢生根瘤菌的分布與環(huán)境因素間的相關(guān)性。在今后的工作中,有必要增大采樣量對(duì)遼寧地區(qū)花生根瘤菌多樣性進(jìn)行深入研究。

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