張艷華　王惠　王巖

摘要：花生是重要的豆科經(jīng)濟(jì)作物，能與慢生根瘤菌屬的根瘤菌共生固氮，遼寧省的花生種植較廣泛，但是對(duì)該地區(qū)花生根瘤菌的研究并不全面。采用16S rDNA和nifH基因的序列分析方法從遺傳學(xué)角度對(duì)17株分離自遼寧省不同地區(qū)的花生根瘤菌的特性進(jìn)行研究。根據(jù)16S rDNA基因的序列分析將所有菌株分為4個(gè)類群，而nifH基因的序列分析方法將供試菌株分成兩大類群，2種方法的分類結(jié)果大體一致，測(cè)序結(jié)果表明所有菌株都屬于慢生根瘤菌屬。說明遼寧省花生慢生根瘤菌的分布可能與該地的地理環(huán)境存在一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：花生；慢生根瘤菌；系統(tǒng)發(fā)育多樣性

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0067-04

根瘤菌是能與豆科植物的根部組織建立共生固氮系統(tǒng)的土壤微生物，通過此共生固氮系統(tǒng)固定的氮素量對(duì)于陸地生態(tài)系統(tǒng)來說非常重要[1-2]，而且有利于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和退化土地復(fù)墾的可持續(xù)發(fā)展[3]。通常認(rèn)為，共生根瘤菌分布于α-變形菌門的根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬、異根瘤菌屬和固氮根瘤菌屬[4]，但是隨著根瘤菌分類學(xué)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些屬于β-變形菌門的根瘤菌，例如伯克氏菌屬和貪銅菌屬的微生物[5]。

花生（Arachis hypogaea L.）別稱落花生，是一種重要的農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)豆科作物，可被用作糧食作物、油料作物和用于生產(chǎn)多種食品，通常認(rèn)為可與慢生根瘤菌共生進(jìn)行固氮，其耐旱性、固氮能力和耐陰性使其成為與玉米、高粱、谷子和其他禾本科作物進(jìn)行間作的重要豆科植物[6]。我國(guó)是世界上花生的進(jìn)出口大國(guó)，花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)于增加農(nóng)民收入、促進(jìn)國(guó)內(nèi)食品安全發(fā)展和改善人們生活水平有重要的意義。

共生固氮效力是衡量花生與本土根瘤菌共生系統(tǒng)的重要因素。在花生種植上接種根瘤菌有很好的固氮效果，然而固氮效果受所接種根瘤菌與本土根瘤菌間的競(jìng)爭(zhēng)影響很大[7]，因此，從本地篩選出具有結(jié)瘤、固氮和高效競(jìng)爭(zhēng)能力的根瘤菌菌株非常重要[8]。然而，盡管花生在遼寧省種植較廣泛，但是關(guān)于本地根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性的相關(guān)報(bào)道并不多，本研究的目的在于通過對(duì)16S rDNA和nifH基因序列差異性分析，對(duì)本地花生根瘤菌的特性、種群和系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行研究，評(píng)估地理變異，有助于改善豆科作物接種根瘤菌、提高固氮量的策略[9-10]。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集

本研究所用菌株的來源和地理環(huán)境列在表1中。所選菌株直接分離自遼寧省不同地理區(qū)域所種植的花生根瘤中，每株植物上隨機(jī)采集1～2個(gè)紅色根瘤，從根瘤中分離細(xì)菌的方法如下：根瘤用95%乙醇表面消毒30 s，隨即在0.1% HgCl2溶液中浸泡3～5 min，然后用無菌蒸餾水洗滌5～6次，夾破根瘤并在含有剛果紅的酵母浸出物-甘露醇培養(yǎng)基（YMA）平板上劃線[11]，將平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)2～7 d長(zhǎng)出單菌落，隨后挑取長(zhǎng)出的分離物，經(jīng)過稀釋涂布平皿純化，挑取單菌落，-80 ℃冰凍保存在含有20%甘油的YMA液體培養(yǎng)基中[7]。根據(jù)菌株較慢的生長(zhǎng)速度和在含有溴麝香草酚藍(lán)（BTB）的YMA平板上產(chǎn)堿（培養(yǎng)基由草綠色變?yōu)樗{(lán)色）初步推斷屬于慢生根瘤菌屬[12]。通過結(jié)瘤試驗(yàn)驗(yàn)證菌株是否具有使花生結(jié)瘤的能力。

1.2 結(jié)瘤試驗(yàn)

對(duì)所有供試菌株包括從中國(guó)科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所獲得的參照菌株（慢生根瘤菌屬的1 024菌株）在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盆栽結(jié)瘤試驗(yàn)?；ㄉN子表面消毒的方法與前面根瘤表面消毒的方法相同[11]，置于含有濕潤(rùn)紗布的無菌平板中在28 ℃條件下催芽，待胚芽長(zhǎng)到約2.0 cm時(shí)，播種到裝有蛭石和無氮營(yíng)養(yǎng)液并在121 ℃下滅菌1 h的玻璃罐中，每罐播種2粒，并在根部接種1 mL供試菌的菌懸液（約0.1億個(gè)細(xì)胞/mL），每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)并設(shè)置空白對(duì)照。將盆栽置于特定的環(huán)境下培養(yǎng)（28 ℃，每天光照16 h，相對(duì)濕度50%），適當(dāng)補(bǔ)澆無菌水，每月澆2次無氮營(yíng)養(yǎng)液[11]。接種45 d后收獲植株，記錄每個(gè)處理的結(jié)瘤數(shù)。內(nèi)部呈現(xiàn)紅色的根瘤視為有效根瘤。

1.3 DNA提取

提取DNA前，將供試菌株在YMA平板上劃線活化，28 ℃ 培養(yǎng)至長(zhǎng)成單菌落，挑取單菌落接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期（0.4<0.6）用于提取總DNA，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增和16S rDNA基因序列測(cè)定

選取每一樣地的代表菌株，DNA提取后，用引物fD1（5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和rD1（5′-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3′）擴(kuò)增16S rDNA基因。PCR程序按照Weisburg等的方法[9]操作，在1%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行PCR產(chǎn)物效果檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照，效果較好的產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 PCR擴(kuò)增和nifH基因序列測(cè)定

由于nifH基因編碼固氮還原酶，為了研究根瘤菌的共生特性，筆者分析了nifH基因，用特異性引物nifHF（5′-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′）和nifHR（5′-AGCATGTCYTCSAGYTCNT CCA-3′）擴(kuò)增nifH基因，PCR程序參考Gurkanli等的研究[13]。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照，送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過NCBI上的BLAST工具進(jìn)行菌株的同源性分析，在BLAST數(shù)據(jù)庫獲取相似序列以及慢生根瘤菌屬參比菌株的基因序列，用MEGA 4.0軟件的CLUSTAL W功能進(jìn)行相似性比對(duì)[14]，序列比對(duì)后，用MEGA 4.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。發(fā)育樹的自展檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)序列隨機(jī)選取500個(gè)重復(fù)來評(píng)估發(fā)育樹拓?fù)鋵W(xué)的可靠性，用Kimura 2-Parameter模型（K2P）來計(jì)算基因間距離。

1.7 核苷酸序列入庫編號(hào)

12個(gè)菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列和17個(gè)菌株的nifH基因的核苷酸序列存放在GenBank中，序列編號(hào)分別為KR092316-KR092327和KR092328-KR092344。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生長(zhǎng)性能

本研究中的所有供試菌株都能使花生結(jié)瘤，初步證明這些菌株都屬于根瘤菌。28 ℃條件下，供試菌株在YMA平板上長(zhǎng)出單菌落約需要1周的時(shí)間，菌落呈乳白色，不透明或半透明，邊緣光滑，所有菌株因產(chǎn)生堿性物質(zhì)而使含有BTB的YMA培養(yǎng)基平板由草綠色變?yōu)樗{(lán)色（圖1）。這一結(jié)果進(jìn)一步表明供試菌株屬于慢生根瘤菌屬。

2.2 16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

每個(gè)供試菌株的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增后都產(chǎn)生約145 kb的單一條帶。對(duì)從不同地區(qū)采集的12株代表菌株的16S rDNA序列的BLAST進(jìn)行分析，結(jié)果表明它們都屬于慢生根瘤菌屬，與Bradyrhizobium japonicum有最大的相似性。

根據(jù)遼寧省本土花生慢生根瘤菌16S rDNA基因序列所做的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。與最相近的參考菌株有至少97%的序列相似性作為菌株分群的標(biāo)準(zhǔn)，在16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析中，所有菌株被分為4個(gè)類群，不同地區(qū)菌株的區(qū)別顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹上（圖2）。所分成的4個(gè)類群都與B. japonicum有較高的序列相似性，F(xiàn)3屬于類群Ⅰ，它分離自遼寧省的北部，與B. japonicum USDA6最相近，相似性達(dá)到99%；C1、F2、F4和O屬于類群Ⅱ，它們分離自遼寧省的北部和中部。菌株B2、H4、G2、J1、J3和4被歸為類群Ⅲ，除了H4

分離自遼寧省的北部，其余的都是在遼寧省的西部地區(qū)采集的；僅P2菌株歸為類群Ⅳ，它分離自遼寧省的西部。由于采集自同一地區(qū)的菌株樣本有被歸到不同類群的現(xiàn)象，16S rDNA類型與地理位置的相關(guān)性不太明顯，但仍然有一定的相關(guān)性。

2.3 nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

每一菌株的nifH基因PCR產(chǎn)物均產(chǎn)生約0.75 kb的單一條帶。對(duì)17株菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST，都顯示與慢生根瘤菌屬的菌株有較高的同源性。根據(jù)遼寧省本土花生慢生根瘤菌nifH基因序列測(cè)定結(jié)果所進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖3。以與最近的參考菌株有不少于97%的序列相似性作為菌株分群的標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)發(fā)育樹可分為兩大類群，都屬于B. japonicum，與B. japonicum USDA110有至少97%的序列相似性，每一類群與相應(yīng)地理區(qū)域大致對(duì)應(yīng)。類群A的菌株包括P2、H4、4、F3、F4、01、F1、F2、C1，屬于北部和中部氣候區(qū)，類群B菌株包括B3、B4、B1、B2、E1、J1、G2、J3，分離自西部和中部地區(qū)。與16S rDNA基因序列分析相比，nifH基因的共生基因類群A對(duì)應(yīng)16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，nifH基因類群B與 16S rDNA 基因類群Ⅲ相對(duì)應(yīng)，都屬于B. japonicum。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，從遼寧省不同地區(qū)的花生種植區(qū)分離出17株根瘤菌，依據(jù)回接結(jié)瘤能力、在含有BTB的YMA平板上產(chǎn)生堿性物質(zhì)的能力、16S rDNA和nifH基因序列分析的結(jié)果，這些菌株都被歸為慢生根瘤菌屬。16S rDNA基因和管家基因常被用作分子系統(tǒng)學(xué)分類和評(píng)估慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的的標(biāo)記。本研究中，通過16S rDNA和nifH基因序列分析證明17株菌株都屬于B. japonicum，即B. japonicum是遼寧省慢生根瘤菌的優(yōu)勢(shì)種。遼寧省的地勢(shì)北部高，南部地，從陸地向海洋傾斜，可以大致的分為3個(gè)地理區(qū)域：西部高地、中部平原、東部丘陵。因此，地勢(shì)的差異可能影響本土根瘤菌的分布，在本研究中，依據(jù)16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，供試菌株被分為4個(gè)類群，所有類群都與B. japonicum有較高的序列相似性，而依據(jù)nifH基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試菌株分類兩大類，在這2種系統(tǒng)發(fā)育樹間有較大的相似性，與16S rDNA基因序列分析相比，nifH基因的共生基因類群A對(duì)應(yīng)16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，nifH基因類群B與16S rDNA基因類群Ⅲ相對(duì)應(yīng)，從每一類群中菌株的分布可以推測(cè)地理因素與本土根瘤菌的分布有一定的相關(guān)性。

然而，由于每一樣地取樣量相對(duì)較小，降低了供試菌株的數(shù)量，可能低估了遼寧本地慢生根瘤菌的生物多樣性。盡管有些研究報(bào)道了有快生根瘤菌使花生結(jié)瘤的現(xiàn)象[16-17]，但與花生共生結(jié)瘤的菌株大部分都屬于慢生根瘤菌[18-20]，在本研究中，從花生根瘤中只分離出慢生根瘤菌，并未見快生菌結(jié)瘤的現(xiàn)象。

有研究顯示，根瘤菌的分布、多樣性和本土性受土壤類型和氣候環(huán)境影響[11，21-22]。在對(duì)大豆所作的研究中，溫度和土壤pH值與尼泊爾地區(qū)根瘤菌種水平的分布有很大的相關(guān)性[10]。Dinesh等也報(bào)道了尼泊爾地區(qū)不同地理環(huán)境豇豆根瘤菌的分布多樣性[23]。

總之，盡管本研究中供試菌株的多樣性并不高，但是也對(duì)遼寧省不同地理區(qū)域本土花生慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性進(jìn)行的初步分析。結(jié)果顯示，遼寧省花生慢生根瘤菌可能依賴于地理位置而分布，這也暗示本土慢生根瘤菌的分布與環(huán)境因素間的相關(guān)性。在今后的工作中，有必要增大采樣量對(duì)遼寧地區(qū)花生根瘤菌多樣性進(jìn)行深入研究。

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