姜上川 梅超 王小芳 張大鵬

摘要：為研究天然植物激素脫落酸（ABA）作為轉(zhuǎn)基因植物選擇性除草劑以實現(xiàn)環(huán)境友好型除草策略的可能性，采用改變擬南芥SOAR1基因表達的方法可以大幅度調(diào)控植物對ABA的耐受性，通過SOAR1基因過量表達獲得對ABA耐受性高度增強的轉(zhuǎn)基因植物。進一步通過植物在不同生長時期對ABA耐受性的試驗檢測ABA除草劑的有效濃度。結(jié)果表明，SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因植物種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA的耐受性超出了目前已知的極限，過量表達株系OE1、OE3和OE6所能夠耐受ABA的最高濃度在種子萌發(fā)期為200 μM，在幼苗期生長期為500 μM。以最大限度抑制雜草生長發(fā)育和最少影響作物正常生長發(fā)育為前提，設(shè)定ABA除草劑的有效除草濃度范圍在種子萌發(fā)期為3～100 μM，在幼苗生長期為10～200 μM。

關(guān)鍵詞：脫落酸； SOAR1； ABA耐受性； 轉(zhuǎn)基因植物； ABA除草劑

中圖分類號：S451 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1172-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.021

Potential Weed Control Based on High ABA Tolerance of SOAR1-overexpression Plants

JIANG Shang-chuan， MEI Chao， WANG Xiao-fang， ZHANG Da-peng

（ School of Life Sciences， Tsinghua University， Beijing 100084，China ）

Abstract： To study the potential eco-friendly weed control strategy with abscisic acid （ABA） as the selective herbicide for transgenic plants， we employed plant materials with changes in the expression level of SOAR1 which sharply regulate ABA tolerance in Arabidopsis. Transgenic plants with dramatically increased ABA tolerance can be obtained by overexpressing SOAR1. Additionally， a set of ABA tolerance assays during different growth stages were conducted to test the effective concentration of ABAs herbicidal activity. The results showed that the ABA tolerance of SOAR1-overexpression plants goes beyond the known extremity， and the highest endurable concentration of ABA for overexpression lines OE1， OE3 and OE6 was 200 μM during seed germination and 500 μM during seedling growth， respectively. With the precondition of maximum growth repression of weed and minimum growth inhibition of transgenic plants， the effective concentration range of ABAs herbicidal activity was 3～100 μM during seed germination and 10～200 μM during seedling growth， respectively.

Key words： abscisic acid （ABA）； SOAR1； ABA tolerance； transgenic plant； ABA herbicide

天然植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）參與調(diào)控植物生長發(fā)育各個階段，包括種子休眠、萌發(fā)，幼苗生長、側(cè)根生長、氣孔運動以及營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換等過程，并在植物對外界多種逆境脅迫的響應(yīng)中起著重要作用[1-3]。

擬南芥中有450多個PPR（Pentatricopeptide repeats）基因家族成員。PPR蛋白在細胞內(nèi)主要分布在線粒體、葉綠體或其他亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)，參與細胞器mRNA的加工過程，包括剪切、剪接、穩(wěn)定、RNA編輯以及蛋白質(zhì)翻譯起始和核糖體組裝[4]。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)幾個PPR蛋白參與了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，如PPR40[5]、ABO5[6]、SLG1[7]、PGN[8]與AHG11[9]等。所有這些PPR蛋白均定位在線粒體中，并可能通過調(diào)節(jié)細胞器中的活性氧產(chǎn)生來參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

清華大學生命科學學院實驗室在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的一種細胞質(zhì)-核定位的PPR蛋白SOAR1參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10，11]。研究發(fā)現(xiàn)，改變SOAR1的基因表達可以大幅度調(diào)控植物對ABA的耐受性；尤其是SOAR1過表達植物種子萌發(fā)和幼苗生長對ABA的耐受性超出了目前已知的極限[10，11]。本研究通過SOAR1基因過量表達，獲得對ABA耐受性高度增強的轉(zhuǎn)基因植物，為天然植物激素ABA作為轉(zhuǎn)基因植物的選擇性除草劑、實現(xiàn)環(huán)境友好型綠色除草提供一種可能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

①擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col）種子購自美國俄亥俄州立大學擬南芥生物資源中心（ABRC）；②SOAR1基因表達調(diào)低的2個T-DNA插入突變體soar1-2和soar1-3種子購自凡爾賽遺傳學和植物育種實驗室擬南芥資源中心（http：//dbsgap.versailles.inra.fr/portail/），SOAR1（AT5G11310）基因T-DNA插入突變體soar1-2（FLAG_546D07）和soar1-3（FLAG_500B04），其遺傳背景為Col生態(tài)型；③擬南芥野生型Col用于獲得SOAR1轉(zhuǎn)基因過表達植物。SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因植株OE1、OE3和OE6等為本實驗室獲得并保存；④ABI2 （AT5G 57050）轉(zhuǎn)基因過表達植株ABI2-OE為本實驗室保存[12]，ABI5（AT5G36270）功能缺失突變體abi5-1 （CS8105：abi5-1）為本實驗室保存并與野生型Col回交。這兩個遺傳材料都是公認的ABA不敏感突變材料[12，13]，其中ABI2-OE對ABA強烈脫敏[10-12]。以上所有植物材料均經(jīng)過了分子鑒定[10，11]。

1.2 植物生長條件

在超凈工作臺中，用0.5%（V/V）次氯酸鈉溶液浸泡漂洗擬南芥種子15 min，再用無菌水漂洗5次，之后將種子播在MS固體培養(yǎng)基上。4 ℃低溫層積處理3 d后，將平板放入光照培養(yǎng)箱生長10 d左右，將幼苗移栽到營養(yǎng)土中生長。光周期為16 h/8 h（光照/黑暗），溫度為20～22 ℃，光照強度為120 μm/m2s。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOAR1過量表達株系種子萌發(fā)期ABA除草濃度的選擇區(qū)間

將擬南芥野生型Col、SOAR1過量表達株系OE1、OE3和OE6、SOAR1低表達突變體soar1-2和soar1-3、ABA不敏感對照ABI5功能缺失突變體abi5-1以及具有顯著ABA脫敏表型的ABI2過量表達株系A(chǔ)BI2-OE種子直接播種在含有一系列不同濃度ABA （0、3、5、10、100和200 μM）的MS培養(yǎng)基上，4 ℃下低溫層積3 d后移入光照培養(yǎng)箱中，14 d后觀察幼苗對ABA的耐受情況，如圖1-A所示。

在含0 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，各遺傳材料的幼苗生長差異不顯著（圖1-B）。從濃度3 μM ABA開始，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col表現(xiàn)出無法耐受，其生長發(fā)育狀態(tài)基本停滯。而在10 μM ABA培養(yǎng)基上SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的真葉與根系生長幾乎不受ABA影響，其真葉與根系仍能正常生長發(fā)育，與無ABA（0 μM）培養(yǎng)基上生長狀態(tài)接近。

在高達100 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，擬南芥野生型Col被ABA強烈抑制，突變體soar1-2和soar1-3受抑制程度更高，基本上完全不萌發(fā)；而SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因株系幼苗仍能正常生長出真葉與根系。SOAR1過量表達株系對ABA的耐受程度顯著高于對ABA不敏感突變體abi5-1，并略高于ABI2過量表達株系A(chǔ)BI2-OE。在含有200 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的生長受到ABA的抑制。

結(jié)果表明，在種子直接萌發(fā)生長條件下，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col（視同雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為3 μM；過表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6（視同作物）所能夠耐受ABA的最高濃度為200 μM?？紤]到ABA濃度要高到能足以抑制雜草種子萌發(fā)，又盡量減少對SOAR1轉(zhuǎn)基因株系（作物）的萌發(fā)生長的影響，因此在種子萌發(fā)期，ABA除草劑的有效除草濃度范圍為3～100 μM。

2.2 SOAR1過量表達株系幼苗生長早期ABA除草濃度的選擇區(qū)間

如圖2-A所示，將擬南芥野生型Col，SOAR1過表達株系OE1、OE3和OE6，SOAR1低量表達突變體soar1-2和soar1-3，ABA不敏感對照ABI5功能缺失突變體abi5-1以及具有顯著ABA脫敏表型的ABI2過量表達株系A(chǔ)BI2-OE種子直接播種在正常MS培養(yǎng)基上，4 ℃下低溫層積3 d，然后移入光照培養(yǎng)箱中生長48 h后，再將剛萌發(fā)的幼苗分別移入含有不同濃度ABA （0、 5、10、50、200和500 μM）的培養(yǎng)基上，生長12 d后觀察幼苗生長的情況。

由圖2-B可知，在含0 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，各遺傳材料的幼苗生長差異不顯著。而從5 μM開始到10 μM ABA的MS培養(yǎng)基上，野生型Col、突變體soar1-2和soar1-3移苗生長后生長狀態(tài)受到ABA強烈抑制（子葉不能變綠、根部幾乎不能生長）。而在含有20 μM ABA的MS培養(yǎng)基上SOAR1過量表達株系OE1、OE3和OE6幼苗的真葉與根系生長狀態(tài)幾乎沒有受到ABA的抑制，與無ABA的MS培養(yǎng)基上生長狀態(tài)接近，其對ABA的耐受能力高于abi5-1以及ABI2過表達株系A(chǔ)BI2-OE。ABA不敏感突變體abi5-1受ABA抑制程度與野生型接近。

在200 μM ABA處理后，野生型Col、突變體soar1-2和soar1-3、ABA不敏感突變體abi5-1不能耐受ABA處理，幾乎停滯生長；而SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗子葉仍能轉(zhuǎn)綠，真葉與根系仍能生長，其對ABA耐受能力仍強于ABI2-OE。直到500 μM ABA處理后，SOAR1過量表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6幼苗才能顯現(xiàn)出受到ABA抑制的表型。

以上結(jié)果表明，在移苗生長條件下，突變體soar1-2和soar1-3與野生型Col（視同雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為10 μM；過表達轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE3和OE6（視同作物）所能夠耐受ABA的最高濃度為500 μM。如上所述，考慮到ABA濃度要高到能足以抑制雜草種子萌發(fā)，又盡量減少對SOAR1轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)生長的影響，因此在幼苗期生長早期，ABA除草劑的有效濃度范圍應(yīng)該為10～200 μM。

3 小結(jié)與討論

本研究通過SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（視同作物）與野生型Col、SOAR1低表達突變體等（視同雜草），在不同生長時期對ABA耐受性的對比試驗，ABA除草劑的有效除草濃度范圍是以最大限度抑制雜草生長發(fā)育和最少影響作物正常生長發(fā)育為前提的試驗數(shù)據(jù)。得出如下結(jié)論。

1）在種子萌發(fā)期，SOAR1表達調(diào)低的植物（雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為3 μM；而SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因植物（作物）所能夠耐受ABA的濃度高達200 μM。ABA除草劑的有效除草濃度范圍可設(shè)定為3～100 μM。

2）在幼苗生長早期，SOAR1表達調(diào)低的植物（雜草）所能夠耐受ABA的最高濃度為10 μM；而SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因植物（作物）所能夠耐受ABA的濃度高達500 μM。因此ABA除草劑的有效除草濃度范圍可設(shè)定為10～200 μM。

近年來現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中化學除草劑的使用量日益增加，長期大量使用化學除草劑帶來的有害化學物質(zhì)殘留造成嚴重環(huán)境污染，危及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，不僅對作物產(chǎn)生藥害，同時影響人畜健康，亟待采取有效措施加以控制。研究開發(fā)天然植物激素類（或激素類似物）除草劑，即利用植物生長調(diào)節(jié)劑（包括人工合成和提取的天然植物激素或激素類似物等），取代化學除草劑是未來的發(fā)展趨勢。天然植物激素ABA抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，可以利用這個特性開發(fā)出一種潛在的除草劑。但要用ABA作為除草劑，作物必須能耐受高濃度的ABA。SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥株系表現(xiàn)為對ABA強烈脫敏，幾乎完全阻斷ABA信號傳導(dǎo)，可以耐受高濃度的ABA。以上證據(jù)表明，通過獲得SOAR1過表達轉(zhuǎn)基因作物，為利用天然植物激素ABA作為環(huán)境友好型綠色除草劑提供了可能的選擇。當然，過量表達SOAR1基因在作物中的表現(xiàn)，以及其他作物中的SOAR1類似基因的開發(fā)，還需要有進一步的研究資料。此外，ABA及其合成類似物的低成本也是生產(chǎn)上有用的前提條件。隨著ABA發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的突破，ABA工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)必將為利用天然植物激素ABA除草在農(nóng)業(yè)中推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。可以預(yù)計，利用ABA作為轉(zhuǎn)基因植物的選擇性除草劑具有很高的經(jīng)濟效益和廣闊的發(fā)展前景。

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