曾壟鋼 魯海菊 盧寧強(qiáng) 潘柳君 鄭肖蘭

摘要：本試驗(yàn)采用生長(zhǎng)速率法對(duì)抗石榴干腐病病原真菌的6株枇杷（Eriobotrya japonica）果皮內(nèi)生真菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，PGSC8菌株在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，PGSC9在PDA和CA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，PGSC1、PGSC5、PGSC6、PGSC7 4個(gè)菌株在PSA培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最好。供試的碳源中，PGSC5和PGSC6 2個(gè)菌株最適碳源為麥芽糖，PGSC1、PGSC7、PGSC8、PGSC9 4個(gè)菌株最適碳源為可溶性淀粉。供試氮源中，PGSC6、PGSC9 2個(gè)菌株最適氮源為牛肉膏，PGSC7菌株最適氮源為酵母膏和牛肉膏，PGSC1、PGSC5、PGSC8 3個(gè)菌株最適氮源為蛋白胨。所有參試菌株適宜菌絲生長(zhǎng)的pH為中性或偏堿性，PGSC7最適合的生長(zhǎng)溫度為25 ℃，其余5個(gè)菌株最適合的生長(zhǎng)溫度為30 ℃。全光照處理有利于參試菌株菌絲生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：枇杷（Eriobotrya japonica）； 內(nèi)生真菌； 石榴干腐?。?生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S667.3；S476+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1168-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.020

Study of Biological Characteristics of Bio-control Endophytic Fungi

from Eriobotrya japonica

ZENG Long-gang1，2， LU Hai-ju1， LU Ning-qiang1， PAN Liu-jun1， ZHENG Xiao-lan3

（1.Department of Life Science and Technology， Honghe College，Mengzi 661199， Yunnan，China；

2.Yunnan Pingbian Plant Protecting Station， Pingbian 661200， Yunnan，China；

3.Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences Environment and Plant Protection Institute，Danzhou 571737， Hainan，China）

Abstract： The effects of medium， carbon and nitrogen source， pH， temperature and illumination were tested by mycelium growth rate for 6 Eriobotrya japonica endophyte strains significantly antagonized pathogen of fruit dry rot of pomegranate. The results showed that the proper growth medium of PGSC8 strain was PDA. PGSC9 strain was PDA and CA. The other 4 strains was PSA. In the tested carbon sources， the proper carbon source of 2 strains including PGSC5 and PGSC6 was the maltose. The other 4 strains was the soluble starch. In the tested nitrogen sources， the proper nitrogen source of 2 strains including PGSC6 and PGSC9 was the beef extract， and PGSC7 strain was the yeast extract and the beef extract. The other 3 strains was the peptone. And the proper pH of all the tested strains was neutral or alkaline， the proper temperature of PGSC7 was 25 ℃. The other 5 strains was 30 ℃.

Key words： Eriobotrya japonica； endogenetic fungus； fruit dry rot of pomegranate； biological characteristics

枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木果樹(shù)，是中國(guó)亞熱帶地區(qū)的特色水果[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，含川貝堿、西貝素等多種生物堿[2]。植物內(nèi)生真菌普遍存在于各種植物健康組織內(nèi)或細(xì)胞間隙，不僅能促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)，還可以產(chǎn)生與寄主相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗菌、殺蟲(chóng)等多種生物活性[3-6]。目前，尚未見(jiàn)枇杷內(nèi)生真菌的研究報(bào)道。為此，本課題組對(duì)枇杷內(nèi)生真菌開(kāi)展系列研究。石榴干腐病是石榴生產(chǎn)上發(fā)生嚴(yán)重而普遍的病害之一，陜西[7]、安徽[8]、河南[9，10]、云南[11]等省份都陸續(xù)報(bào)道有石榴干腐病發(fā)生，損失率高達(dá)40%[7]以上。此病害果實(shí)腐爛干縮是其癥狀之一，果部病害使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)出現(xiàn)農(nóng)藥殘留問(wèn)題，生物防治可以彌補(bǔ)其不足。鑒于此，本試驗(yàn)從枇杷果皮內(nèi)生真菌中篩選具有抗石榴干腐病病原菌的生防菌株，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為工業(yè)發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枇杷主干內(nèi)生真菌 從蒙自枇杷園區(qū)采集枇杷果皮，常規(guī)組織分離[10]獲得6株參試菌株，分別為PGSC1、PGSC5、PGSC6、PGSC7、PGSC8和PGSC9，均為鏈格孢屬（Alternaria spp.）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 ①馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉 20 g、去離子水1 000 mL。②馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。③玉米粉培養(yǎng)基（CM）：玉米粉30 g、瓊脂粉17 g、去離子水1 000 mL。④小麥瓊脂培養(yǎng)基（WA）：小麥粉30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑤枇杷瓊脂培養(yǎng)基（LA）：枇杷葉200 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑥胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）：胡蘿卜200 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。⑦查氏培養(yǎng)基（Czapeks medium CZ）：硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL。以上所有配制好的培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌25 min備用。

1.1.3 藥品及試劑 碳源有可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇；氮源有酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨。上述材料均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定 將枇杷主干內(nèi)生真菌接種在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)7 d [12]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，同時(shí)接種于PDA、PSA、CM、WA、CA、LA 和CZ 7種培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后十字交叉法[12]測(cè)定各菌株菌落直徑。

1.2.2 碳、氮源對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳（可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇）和氮（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.3 pH對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定 以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉將pH調(diào)至4、5、6、7、8、9和10，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.4 溫度對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在5、10、15、20、25、30、35和40 ℃下恒溫培養(yǎng)，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.5 光處理對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)影響的測(cè)定 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)，接種及測(cè)量方法同“1.2.1”[12]。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表1可知，7種供試培養(yǎng)基中，PGSC1、PGSC5、PGSC6和PGSC7 4個(gè)菌株在PSA培養(yǎng)基中的菌落直徑與其他培養(yǎng)基差異極顯著，且菌落直徑最大，說(shuō)明這4株內(nèi)生菌最適合的培養(yǎng)基為PSA。PGSC8和PGSC9 2個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基中的菌落直徑與其他培養(yǎng)基差異極顯著，且菌落直徑最大，說(shuō)明這2株內(nèi)生菌最適合的培養(yǎng)基為PDA。此外CA培養(yǎng)基也適合PGSC9和PGSC6菌株生長(zhǎng)。不同供試菌株在其余培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)，只是菌落直徑略小一些?？傊?，參試菌株在不同培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性。

2.2 碳源對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表2可知，參試菌株在可溶性淀粉培養(yǎng)基中，較其他碳源培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)差異極顯著，說(shuō)明6種供試的碳源，最易被其利用的是可溶性淀粉。菌株P(guān)GSC5、PGSC6在麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)也較好。參試菌株P(guān)GSC6在無(wú)碳源對(duì)照上菌絲生長(zhǎng)直徑為12.3 cm，與其他6種培養(yǎng)基差異極顯著，說(shuō)明該菌株對(duì)碳源的需求比其他參試菌株敏感。在無(wú)碳對(duì)照中，PGSC5菌落直徑最大，但菌絲非常稀薄。

2.3 氮源對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表3可知，供試的7種氮源對(duì)參試菌株菌絲生長(zhǎng)存在差異性，總體分析發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源更適合參試菌株菌絲生長(zhǎng)，其中PGSC1、PGSC5和PGSC8最適合的氮源為蛋白胨，PGSC6、PGSC7和PGSC9最適合的氮源為牛肉膏。酵母膏也適合PGSC7菌株生長(zhǎng)。此外參試菌株在無(wú)氮對(duì)照培養(yǎng)基上，有些菌株菌絲生長(zhǎng)較快，但菌絲稀薄。

2.4 pH對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，在不同pH環(huán)境下各參試菌株菌落直徑有差異，PGSC5、PGSC6、PGSC7、PGSC8 4個(gè)參試菌株菌絲生長(zhǎng)最適合的pH為7，其余2株最適合的pH為10。表明pH中性或偏堿性適合參試菌株菌絲生長(zhǎng)。

2.5 溫度對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表5可知，參試菌株在10～35 ℃范圍內(nèi)菌絲均能生長(zhǎng)，5 ℃和40 ℃菌絲均不能生長(zhǎng)。其中，PGSC7最適合的生長(zhǎng)溫度為25 ℃，其余5個(gè)菌株最適合的生長(zhǎng)溫度為30 ℃。

2.6 光照對(duì)不同菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知，在光暗交替（12 h光照12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光照處理下，參試菌株菌絲均能生長(zhǎng)，全光照與其余2種光處理差異極顯著，說(shuō)明全光照有利于參試菌株菌絲生長(zhǎng)。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，參試菌株在7種培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，多數(shù)菌株適合在PSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，PGSC8菌株適合在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，PGSC9在PDA和CA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。多數(shù)菌株最適碳源為可溶性淀粉，PGSC5和PGSC6 2個(gè)菌株最適碳源為麥芽糖。大多數(shù)菌株最適氮源為蛋白胨，PGSC6、PGSC9 2個(gè)菌株最適氮源為牛肉膏，PGSC7菌株最適氮源為酵母膏和牛肉膏。所有參試菌株適宜菌絲生長(zhǎng)的pH為中性或偏堿性，大多數(shù)菌株最適合的生長(zhǎng)溫度為30 ℃，PGSC7最適合的生長(zhǎng)溫度為25 ℃。全光照處理有利于參試菌株菌絲生長(zhǎng)。這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。2011年柏鈺等[13]發(fā)現(xiàn)4種供試培養(yǎng)基中，PSA培養(yǎng)基是1株銀杏內(nèi)生真菌最佳的培養(yǎng)基，其影響大小為PSA>PDA>MA>CZ，中性偏堿性條件下生長(zhǎng)最好。2008年金文進(jìn)等[14]發(fā)現(xiàn)在6種供試碳源中，可溶性淀粉最容易被中華羊茅內(nèi)生真菌利用，其利用順序?yàn)榭扇苄缘矸?麥芽糖>蔗糖>葡萄糖>山梨醇>果糖。2010年鄭文龍等[15]發(fā)現(xiàn)在5種供試氮源中，蛋白胨最容易被產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌EFY-21利用，其利用順序?yàn)榈鞍纂?硝酸鉀>硝酸銨>硫酸銨>磷酸二氫銨。本研究還發(fā)現(xiàn)，30 ℃是參試菌株的最適生長(zhǎng)溫度，光照有利于參試菌株菌絲生長(zhǎng)。王仕玉等[16]發(fā)現(xiàn)齒瓣石斛內(nèi)生真菌最適宜溫度為25 ℃，柏鈺等[13]發(fā)現(xiàn)1株銀杏內(nèi)生真菌菌絲的生長(zhǎng)幾乎不受光照條件影響。與本研究結(jié)果均有一定差異，這可能與寄主及其生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

研究所使用的參試菌株是鏈格孢屬真菌，適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛、兼性寄生于植物[17]，部分作為植物內(nèi)生真菌的鏈格孢菌可產(chǎn)具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物。周兵等[18]研究證實(shí)，鏈格孢菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可抑制小麥、水稻等作物上的常見(jiàn)病原菌。此外，鄒鳳蓮等[19]發(fā)現(xiàn)從番紅中分離的鏈格孢內(nèi)生菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)性；雖然本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株之間生物學(xué)特性存在一定的差異，但總體反映出6株枇杷果皮內(nèi)生真菌（鏈格孢）具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。

本次試驗(yàn)對(duì)參試菌株的最佳培養(yǎng)基、最佳碳源、氮源、最適溫度等基本生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，對(duì)參試菌株的工業(yè)發(fā)酵及定殖等方面還需進(jìn)一步研究。

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