賈曉康 黃云梅 李超雄 林煜 林向全 黃美雅 吳銀生

[摘要] 目的 觀察健骨顆粒對成骨細胞G1/S期調(diào)控的影響，探討健骨顆粒促進成骨細胞增殖的作用機制。 方法 制備健骨顆粒血清組、模型血清組和雌二醇血清組。采用酶消化法培養(yǎng)SD大鼠成骨細胞，健骨顆粒含藥血清干預，以模型血清和雌二醇血清為對照。運用流式細胞術檢測成骨細胞增殖周期，熒光定量PCR法檢測成骨細胞G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達。 結果 15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預48 h，成骨細胞增殖速度均明顯快于模型血清組（P < 0.01）；G0/G1期成骨細胞比例明顯降低（P < 0.01），S期、G2/M期細胞比例及增殖指數(shù)則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組能提高成骨細胞Cyclin E、CDK2及轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達（P < 0.01），而降低p21的表達（P < 0.01）。 結論 健骨顆粒通過調(diào)節(jié)成骨細胞G1/S期調(diào)控機制，推進成骨細胞順利通過G1/S檢測點，促進成骨細胞增殖。

[關鍵詞] 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；成骨細胞；細胞周期；G1/S期；健骨顆粒

[中圖分類號] R285.5；R681 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0009-05

[Abstract] Objective To observe the effects of Jiangu Granules on the G1/S phase cell-cycle regulated proteins of osteoblasts， so as to reveal the mechanism of Jiangu Granules in promoting osteoblasts proliferation. Methods The Jiangu Granules-serum group， model-serum group and estradiol-serum group were prepared. Osteoblasts of SD rats were cultivated by enzymatic digestion and intervened with Jiangu Granules-serum， model-serum and estradiol-serum （as control） respectively. The cell cycles were analyzed by flow cytometry， while the fluorescence quantitative PCR was applied to measure cyclin E， CDK2， p21 and E2F-1 mRNA. Results The cell proliferation rates of osteoblasts intervened with estradiol serum and Jiangu Granules-serum for 48 hours were faster than that with the same concentration model-serum （P < 0.01）. Compared with the model-serum group， the proportion of osteoblasts in the G0/G1 phase were significantly reduced after intervention with 15% of estradiol serum and Jiangu Granules-serum for 48 hours （P < 0.01）， while the proportion of cells in S phase， G2/M phase and proliferation index was much higher （P < 0.01）. The expression of cycling E， CDK 2 and transcription factor E2F-1 mRNA of osteoblasts in the Jiangu Granules-serum group and the estradiol-serum group was higher than that of model-serum group （P < 0.01）， while the expression of p21 mRNA was lower than the model-serum group （P < 0.01）. Conclusion Jiangu Granules-serum can adjust the G1/S phase cell-cycle regulated mechanism in osteoblast， so as to push the cells passing G1/S checkpoint and accelerate the proliferation of osteoblast.

[Key words] Postmenopausal osteoporosis； Osteoblast； Cell cycle； G1/S phase； Jiangu Granules

骨質(zhì)疏松癥形成的主要原因是骨形成、骨吸收偶聯(lián)的破壞，使骨形成減少、骨量降低。成骨細胞在骨代謝、骨形成和維持成年骨骼系統(tǒng)正常中有著主要作用[1]，而成骨細胞增殖周期的進程受周細胞周期蛋白的調(diào)控，其中G1/S期檢測點是細胞周期進程中最重要的檢測點[2]，主要受Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F等G1/S期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。前期研究表明，健骨顆?？梢源龠M成骨細胞增殖，對防治骨質(zhì)疏松癥有積極的作用[3-4]。本研究以成骨細胞G1/S期調(diào)控為切入點，觀察補腎健脾中藥健骨顆粒對體外培養(yǎng)成骨細胞G1/S期調(diào)控蛋白Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F mRNA的影響，探討健骨顆粒促進成骨細胞增殖的作用機制，對于進一步認識成骨細胞增殖的機制，治療和預防骨質(zhì)疏松癥有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、山藥、黨參等藥物組成，原藥材購自福建省醫(yī)藥公司，由福建中醫(yī)藥研究院中試車間負責加工制備，每克健骨顆粒含原生藥2.9 g。戊酸雌二醇（德國BAYER公司生產(chǎn)，批號：199A2），購自福州回春醫(yī)藥連鎖有限公司。

1.2 實驗動物

6 月齡清潔級雌性SD大鼠30只[購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2007-0005，編號：2007000514856]，大鼠體重（250±20）g。醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施為福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心鼠類實驗室，清潔級[許可證號：SYXK（閩）2009-0001]。新生24 h內(nèi)的SD大鼠4只[購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（閩）2004-00023]，以酶消化法分離其顱蓋骨成骨細胞進行體外培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑

Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、MTT噻唑藍（Sigma公司）；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液、低糖DMEM 培養(yǎng)基（新西蘭Hyclone公司）；細胞堿性磷酸酶（CAKP）染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TRIZOL（美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREENⅠ 熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海生工生物技術有限公司）；CycleTESTTM Plus DNA Reagent Kit（美國Becton Dickinson公司）。

1.4 儀器與設備

AIR TECH無菌操作臺（蘇凈集團安泰公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（BB16/BB5060型，德國Heraus公司）；超低溫冰箱MDF-U4086s型（日本三洋公司）；Olympus倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；紫外分光光度計Du650型、低溫高速離心機64R型（美國BECKMAN公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國MILIPORE公司）；流式細胞儀FACSCalibur（美國Becton Dickinson公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清制備 30只6月齡SD雌性大鼠，按照隨機數(shù)字表法隨機分成模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組，每組各10只。各組大鼠行雙側卵巢切除術并于術后第13周開始灌胃，雌二醇血清組、健骨顆粒血清組分別給予戊酸雌二醇100 μg/（kg·d）或健骨顆粒2 g/（kg·d），模型血清組喂服生理鹽水2 mL/d。各組動物灌胃12周，于最后1次灌胃1 h后腹主動脈無菌取血，離心分離血清，滅火、過濾除菌后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 成骨細胞培養(yǎng) 取新生SD大鼠4只，采用酶消化法分離收集顱骨成骨細胞進行傳代培養(yǎng)，差速貼壁法進行純化。

1.5.3 MTT法檢測成骨細胞增殖 取第3代細胞以2×103/孔接種于96孔板中，分別加入含5%、10%、15%、20%、25%、30%健骨顆粒血清、雌二醇血清或模型血清的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度設6孔，干預48 h后MTT法檢測比較不同濃度含藥血清和模型血清對細胞增殖的影響，并得出最佳含藥血清濃度。

1.5.4 成骨細胞的分組干預 取第3代細胞以1×105/mL傳代接種于培養(yǎng)瓶中，根據(jù)不同的分組分別加入不同含藥血清，各組分別加入含最佳濃度健骨顆粒血清的DMEM培養(yǎng)基、相應濃度模型血清或雌二醇血清培養(yǎng)基，每組設6孔，于干預培養(yǎng)48 h后，采用流式細胞術分析成骨細胞的細胞周期，采用實時熒光定量PCR SYBR GREEN法檢測Cyclin E、CDK2、p21和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達。

1.5.5 流式細胞術檢測 按試劑說明書提供的實驗步驟進行上機前處理，上流式細胞儀檢測，應用CellQuest軟件獲取細胞100個，ModFit軟件分析DNA數(shù)據(jù)，讀取G0/G1期、S期、G2/M期細胞數(shù)，計算細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。

1.5.6 實時熒光定量PCR法檢測Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21 mRNA表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供實驗步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，合成Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21擴增引物，根據(jù)兩步法標準Real Time PCR擴增程序進行擴增，用參照基因β-actin對所有樣品進行校正，7500型實時定量PCR儀軟件分析時，以模型血清組中某一樣本mRNA的表達量作為“1”，計算出各組其他樣本的相對表達量（即RQ值），利用各組樣本的RQ值進行統(tǒng)計，比較組間mRNA相對含量[5]。

Cyclin E、CDK2、E2F-1、p21引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 15.0軟件包進行處理分析，實驗數(shù)據(jù)采用均值±標準差（x±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA（單向方差分析）法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度含藥血清干預后成骨細胞增殖情況

采用MTT檢測成骨細胞增殖，給予不同濃度模型血清、雌二醇血清和健骨顆粒血清干預48 h后，模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細胞增殖速度因干預濃度的不同而差異明顯。在血清濃度低于20%前，成骨細胞隨血清濃度的增加而增殖加快；當血清濃度達到20%時，各組成骨細胞增殖最快；血清濃度繼續(xù)升高則細胞增殖逐漸降低。其中，雌二醇血清組和健骨顆粒血清組細胞增殖速度明顯快于同濃度模型血清組，以15%濃度時增殖速度與模型血清組差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；健骨顆粒血清組成骨細胞增殖速度與雌二醇血清組相近，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。取15%血清作為干預成骨細胞的最佳濃度，進行后續(xù)實驗。

2.2 不同含藥血清干預48 h前后成骨細胞鏡下觀察

不同含藥血清干預前后成骨細胞的鏡下觀察，可見干預前成骨細胞排列不整齊，細胞數(shù)量少，且細胞間隙大，見圖1A。而干預后三組細胞數(shù)量都有增加，但模型血清組干預48 h后的，細胞間隙較大，見圖1B。而健骨顆粒血清組與雌二醇血清組干預48 h后細胞形態(tài)較一致，排列較整齊，細胞間隙較窄，同視野下細胞數(shù)量明顯比模型血清組密度大，見圖1C～D。

2.3 不同含藥血清干預后成骨細胞細胞周期的分布

流式細胞術檢測結果顯示，與模型血清組比較，15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預48 h后，G0/G1期成骨細胞比例明顯降低（P < 0.01），而S期、G2/M期細胞比例及PI則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組二組的成骨細胞周期分布情況相近，二者比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。此外，模型血清組細胞周期分布圖中G0/G1期之前出現(xiàn)明顯的凋亡峰，而雌二醇血清組與健骨顆粒血清組細胞凋亡峰明顯降低，甚至消失。見圖2、表3。

2.4 不同含藥血清干預后成骨細胞G1/S期調(diào)控蛋白mRNA表達

2.4.1 成骨細胞Cyclin E mRNA的表達 以15%濃度的不同血清干預成骨細胞48 h后，熒光定量PCR檢測顯示，與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細胞Cyclin E mRNA表達（RQ值）升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組Cyclin E mRNA表達相近，二者差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表4。

2.4.2 成骨細胞CDK2 mRNA的表達 熒光定量PCR檢測15%血清干預48 h后模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細胞CDK2 mRNA結果顯示，與模型血清組比較，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細胞CDK2 mRNA表達大大增加，組間比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）；而雌二醇血清組與健骨顆粒血清組CDK2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表5。

2.4.3 成骨細胞p21 mRNA的表達 熒光定量PCR檢測成骨細胞p21 mRNA結果顯示，15%模型血清、雌二醇血清和健骨顆粒血清分別干預模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組成骨細胞48 h后，雌二醇血清組與健骨顆粒血清組成骨細胞 p21 mRNA表達情況相近（P > 0.05），均明顯低于模型血清組（P < 0.01）。見表6。

2.4.4 成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA 的表達 以15%濃度的不同血清干預成骨細胞模型血清組、雌二醇血清組和健骨顆粒血清組48 h后，熒光定量PCR檢測顯示，健骨顆粒血清組成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA表達明顯高于模型血清組，但遜于雌二醇血清組，組間比較差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見表7。

3 討論

祖國醫(yī)學認為腎虧脾虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病基礎[6-7]，腎虛為骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的根本，而脾虛是骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生的重要病機，在治療上以補腎健脾之法作為開藥法則，可有效防止人體骨量的丟失[8]。用補腎方藥探討骨質(zhì)疏松癥分子生物學機制為基礎醫(yī)學研究的熱點[9-11]。復方中藥能夠促進成骨細胞增殖分化，提高骨密度[12]，針對“腎虧脾虛”的病機特點，補腎健脾中藥健骨顆粒以“補先后天”的理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等藥，以補腎健脾，強筋壯骨。前期研究表明，健骨顆粒能通過調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠垂體-腎上腺軸的功能[13]，明顯提高去卵巢大鼠血清E2水平[14]；提高體外培養(yǎng)成骨細胞G1期調(diào)節(jié)蛋白正性調(diào)節(jié)因子Cyclin D1、CDK4蛋白的表達，促進成骨細胞增殖周期G1期進程[15]。

本研究用成骨細胞為新生SD大鼠顱骨培養(yǎng)，純度較高，生物學特征穩(wěn)定，成骨活性和細胞增殖良好。鏡下觀察48 h血清干預后，健骨顆粒血清組與雌二醇血清組增殖明顯優(yōu)于模型血清組。MTT法檢測不同濃度含藥血清對成骨細胞增殖的影響，雌二醇血清組和健骨顆粒血清組細胞增殖速度明顯快于同濃度模型血清組，以15%濃度時增殖速度與模型血清組差異最顯著（P < 0.01）；健骨顆粒血清組成骨細胞增殖速度與雌二醇血清組相近（P > 0.05）。流式細胞術檢測結果顯示，與模型血清組比較，15%的雌二醇血清與健骨顆粒血清干預48 h后，G0/G1期成骨細胞比例明顯降低（P < 0.01），而S期、G2/M期細胞比例及PI則明顯高于模型血清組（P < 0.01）；雌二醇血清組與健骨顆粒血清組的成骨細胞周期分布情況相近，二者比較無顯著性差異（P > 0.05）。研究表明，雌激素缺乏導致了骨代謝中骨形成及骨吸收的失衡，最終造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生[16-17]。雌激素具有促進成骨細胞增殖的作用，這是通過激活G1/S期的調(diào)節(jié)蛋白促進細胞周期的G1進程來實現(xiàn)的[18-19]。本研究采用不同含藥血清干預后成骨細胞G1/S期調(diào)控蛋白 mRNA表達發(fā)現(xiàn)：用雌二醇作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞，能使成骨細胞Cyclin E、CDK2和轉(zhuǎn)錄因子E2F-1 mRNA的表達明顯提高，而p21 mRNA的表達降低，提示雌二醇能大量激活Cyclin E、CDK2，活化轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，促進G1/S期轉(zhuǎn)換，推動細胞周期進程，促進成骨細胞增殖；并能抑制G1/S期負性調(diào)節(jié)因子p21表達，減少成骨細胞G1周期阻滯，進而抑制成骨細胞G1期凋亡，這可能是雌激素保護成骨細胞凋亡的作用機制之一[20]。而健骨顆粒在促成骨細胞增殖和保護成骨細胞凋亡上，均能發(fā)揮與雌二醇相近的作用。健骨顆粒在推進成骨細胞增殖周期G1期進程后，能進一步激活Cyclin E、CDK2，活化轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，促進G1/S期轉(zhuǎn)換，使細胞增殖進入S期，從而促進成骨細胞增殖；同時抑制p21，減少成骨細胞G1周期阻滯，進而抑制成骨細胞G1期凋亡。健骨顆粒的這一作用可能與其能提高E2水平有關，通過調(diào)控G1/S期相關蛋白來促進成骨細胞增殖。

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（收稿日期：2015-10-28 本文編輯：張瑜杰）