秦崇濤，張捷平，劉如玉，吳世代，施紅

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州350122)

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石斛合劑對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟蛋白表達(dá)的影響

秦崇濤，張捷平，劉如玉，吳世代，施紅

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州350122)

目的從蛋白質(zhì)組學(xué)方面探討石斛合劑對(duì)2型糖尿病模型大鼠肝臟蛋白表達(dá)的影響。方法 取70只大鼠，采用高脂飼料喂養(yǎng)加鏈脲佐菌素腹腔注射的方式建立2型糖尿病模型，取其中30只分為模型組、中藥組和西藥組各10只，另取10只未造模大鼠作為空白組。中藥組灌胃石斛合劑15 g/(kg·d)，西藥組灌胃二甲雙胍100 mg/(kg·d)，模型組、空白組灌胃等劑量生理鹽水，均持續(xù)6周。處死各組大鼠取肝臟，提取肝臟蛋白質(zhì)，采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)，行液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析各組大鼠的肝臟蛋白質(zhì)差異性表達(dá)情況。結(jié)果 共鑒定到蛋白3 585個(gè)、肽段15 221個(gè)。與模型組相比，西藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為65種、上調(diào)蛋白數(shù)量為60種，總差異性蛋白數(shù)量為125種；中藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為195種、上調(diào)蛋白數(shù)量為157種，總差異性蛋白數(shù)量為352種。結(jié)論 石斛合劑可影響糖尿病大鼠肝臟內(nèi)多種與物質(zhì)代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能是其治療糖尿病的機(jī)制之一。

2型糖尿病；肝臟；蛋白質(zhì)組學(xué)；同位素標(biāo)記

糖尿病是嚴(yán)重影響人類健康的代謝類疾病，其中2型糖尿病占90%以上。中藥在糖尿病治療及并發(fā)癥的預(yù)防方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本課題組前期研究表明，石斛合劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用方面對(duì)糖尿病均具有良好的治療效果[1～4]。但石斛合劑治療糖尿病的機(jī)制尚不明確。蛋白質(zhì)組學(xué)是指一種生物、細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，近年來發(fā)展起來的相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)成為比較蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)病機(jī)制及治療的研究[6,7]。2014年3月～2015年5月，我們對(duì)2型糖尿病大鼠應(yīng)用石斛合劑治療，采用iTRAQ技術(shù)對(duì)大鼠治療前后肝臟內(nèi)的差異性表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，探討石斛合劑治療2型糖尿病的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及材料SPF級(jí)雌性Wistar大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。高脂飼料成分包括基礎(chǔ)飼料、蔗糖、膽固醇、膽酸鹽、豬油、蛋黃粉等。iTRAQ試劑購自美國Sciex公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；檸檬酸鈉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2模型制備及動(dòng)物分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)取出10只作為空白組，飼喂普通飼料。其余70只大鼠飼喂高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周后，經(jīng)腹腔注射STZ溶液30 mg/kg制備2型糖尿病模型，空白組不進(jìn)行腹腔注射。5 d后，對(duì)造模大鼠取尾靜脈血測(cè)血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L為2型糖尿病造模成功[8,9]。取造模成功大鼠30只，隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組各10只。

1.3干預(yù)方法造模成功后，中藥組予灌胃石斛合劑15 g/(kg·d)，西藥組予灌胃二甲雙胍100 mg/(kg·d)，模型組、空白組予灌胃等劑量生理鹽水，均持續(xù)6周。

1.4標(biāo)本取材大鼠麻醉后處死，取肝臟，剪成小塊后立即放入液氮中冷凍。

1.5iTRAQ檢測(cè)方法[10]提取肝臟蛋白質(zhì)，對(duì)提取后的蛋白樣品進(jìn)行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)步驟充分酶解蛋白。采用Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。取肝臟蛋白100 μg，按比例加入Trypsin進(jìn)行酶解，用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段。將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合，使用強(qiáng)陽離子交換色譜(SCX)進(jìn)行預(yù)分離，行液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。

1.6差異性蛋白分析方法質(zhì)譜原始文件轉(zhuǎn)換成MGF格式后，利用Mascot2.4軟件搜索IPI蛋白數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性和定量分析。依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，計(jì)算各組間的相對(duì)表達(dá)比值，當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P<0.05時(shí)，視為差異性蛋白。

2　結(jié)果

2.1各組差異性蛋白數(shù)量共鑒定到蛋白3 585個(gè)、肽段15 221個(gè)。與模型組相比，西藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為65種、上調(diào)蛋白數(shù)量為60種，總差異性蛋白數(shù)量為125種；中藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為195種、上調(diào)蛋白數(shù)量為157種，總差異性蛋白數(shù)量為352種。各組主要差異性蛋白名稱及表達(dá)結(jié)果見表1～6。

表1　模型組比空白組上調(diào)的主要蛋白

表2　模型組比空白組下調(diào)的主要蛋白

表3　中藥組比模型組上調(diào)的主要蛋白

表4　中藥組比模型組下調(diào)的主要蛋白

表5　西藥組比模型組上調(diào)的主要蛋白

表6　西藥組比模型組下調(diào)的主要蛋白

3　討論

1994年澳大利亞科學(xué)家最先提出了蛋白質(zhì)組的概念，隨后蛋白質(zhì)組學(xué)研究很快成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組技術(shù)能夠高通量地對(duì)樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析。對(duì)分離蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)技術(shù)也經(jīng)歷了快速發(fā)展。目前，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)定量技術(shù)主要有以下幾種[11]：①以雙向電泳為基礎(chǔ)的定量檢測(cè)：這種技術(shù)因雙向電泳技術(shù)的局限性而受到某些限制，主要體現(xiàn)在某些極酸極堿以及非極性蛋白質(zhì)難以被檢測(cè)；②采用無標(biāo)記的質(zhì)譜進(jìn)行的定量檢測(cè)：這種技術(shù)有很多優(yōu)勢(shì)，但目前還沒有發(fā)展到大規(guī)模應(yīng)用；③采用蛋白芯片技術(shù)進(jìn)行的定量檢測(cè)：這種方法的定量結(jié)果相當(dāng)準(zhǔn)確，但價(jià)格太高，難以大規(guī)模推廣；④采用同位素標(biāo)記聯(lián)合質(zhì)譜分析進(jìn)行的定量檢測(cè)：這是當(dāng)前應(yīng)用最多的方法，主要包括同位素親和標(biāo)記(ICAT) 技術(shù)和iTRAQ技術(shù)。ICAT技術(shù)要求待檢測(cè)樣品一定要含有半胱氨酸[12]，否則就無法進(jìn)行檢測(cè)，而iTRAQ技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了這個(gè)不足。iTRAQ技術(shù)是一種全新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)[6,7]，能夠快速和高通量地對(duì)多組不同樣品中蛋白質(zhì)組之間的差異進(jìn)行研究，并且可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行絕對(duì)和相對(duì)定量。與傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)相比，iTRAQ具有高通量、操作相對(duì)簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有前景的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法。

石斛合劑為在長期基礎(chǔ)和臨床研究基礎(chǔ)上經(jīng)不斷改良所形成的中藥復(fù)方，對(duì)糖尿病、高脂血癥、高血壓均有較好的治療效果[13～16]。研究表明，石斛合劑能夠發(fā)揮較好的穩(wěn)定降低血糖及血脂水平、促進(jìn)胰島細(xì)胞增生、多靶點(diǎn)延緩并發(fā)癥的療效[3,4]。通過肝組織基因表達(dá)芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，石斛合劑可使老年糖尿病鼠近千個(gè)表達(dá)異常的已知功能基因轉(zhuǎn)錄水平得到恢復(fù)[17]。但在蛋白質(zhì)組水平的研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，西藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為65種、上調(diào)蛋白數(shù)量為60種，總差異蛋白數(shù)量為125種；中藥組下調(diào)蛋白數(shù)量為195種、上調(diào)蛋白數(shù)量為157種，總差異性蛋白數(shù)量為352種，其中與糖類和脂類物質(zhì)代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白種類最多，提示西藥組與中藥組治療糖尿病的機(jī)制及對(duì)靶蛋白的影響存在不同。

本研究結(jié)果表明，模型組出現(xiàn)的差異性蛋白在西藥、中藥治療后均可得到部分恢復(fù)，如模型組中上調(diào)的蛋白轉(zhuǎn)乙酰酶、cAMPA依賴的蛋白激酶1型調(diào)節(jié)亞基、60S核糖體蛋白L19、絲切蛋白、線粒體?；鵆oA合成酶家族成員2、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A5、組蛋白H1.0、表皮脂肪酸結(jié)合蛋白等，在中藥組中表達(dá)量均有所減少；而模型組中下調(diào)的含蛋白水解信號(hào)的核蛋白、 旁胸腺素、原肌球蛋白α1型H亞型、含SAP結(jié)構(gòu)域的核糖體蛋白、α內(nèi)磺肽1亞型、Apo E、鈉偶聯(lián)的中性氨基酸載體3等蛋白在中藥組中表達(dá)量有所上升，在西藥組中也存在類似現(xiàn)象，但蛋白種類有所差別，這表明石斛合劑與二甲雙胍治療糖尿病的機(jī)制有所差別。

綜上所述，利用iTRAQ技術(shù)可以檢測(cè)到石斛合劑治療的糖尿病大鼠肝臟蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的變化，造成的差異性蛋白既包括與物質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白，也包括沒有直接參與物質(zhì)代謝或細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白，可能是其治療糖尿病的機(jī)制之一。

[1] 施紅,林求誠,馮亞,等.石斛合劑對(duì)陰虛熱盛、氣陰兩虛型2型糖尿病的療效觀察[J].中藥藥理與臨床,2002,18(3):42-43.

[2] 施紅,林求誠,陳國強(qiáng),等. 石斛合劑對(duì)2型糖尿病的臨床療效觀察[J].中藥新藥與臨床藥理,2002,13(6):348-350.

[3] 施紅,楊奇紅,張捷平,等. 石斛合劑對(duì)高脂高糖加STZ 造模大鼠的作用及機(jī)制探討[J].中藥藥理與臨床,2002,18(3):22-23.

[4] 施紅,楊奇紅,張捷平,等. 石斛合劑對(duì)高脂高糖加鏈脲佐菌素造模大鼠的作用及機(jī)制[J].中國臨床康復(fù),2004,8 (6):1102-1104.

[5] Wilkins MR, Sanchez JC, Cooley AA, et al. Progress with proteome projects：why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it[J]. Biotechnol Genet Eng Rev,1996,13(6):19-50.

[6] Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in saccharomyces cerevisiae using amine reactive isobaric tagging reagents [J]. Mol Cell Proteomics, 2004, 3(12):1154-1169.

[7] Matteucci E, Giampietro O. Proposal open for discussion: defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research[J]. J Ethnopharmacol, 2008,115(2):163-172.

[8] 黃松. 糖尿病動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].廣西醫(yī)學(xué),2002,24(1):46-47.

[9] 金勇,朱勇,吳南翔.實(shí)驗(yàn)性鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大、小鼠糖尿病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(3):80-82.

[10] 秦崇濤,張捷平,劉如玉,等. 利用iTRAQ技術(shù)對(duì)2型糖尿病模型大鼠與正常大鼠的肝臟進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].北方藥學(xué),2014,11(12):108-109.

[11] 楊星,張紀(jì)陽,朱云平,等. 基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記與質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)定量算法研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展,2009,37(1):144-151.

[12] Wu WW, Wang GH, Baek SJ, et al. Comparative study of three proteomic quantitative methods, DIGE, cICAT, and iTRAQ, using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF[J]. J Proteome Res, 2006,5(3):651-658.

[13] 林心君,施紅.施紅教授石斛合劑序貫療法治療糖尿病之思路[J]. 中醫(yī)臨床研究,2014,6(1):18-19.

[14] 施紅,張學(xué)敏,崔乙,等.糖尿病石斛合劑序貫療法的初步臨床觀察[J].中醫(yī)臨床研究,2013,5(18):1-3.

[15] 洪佳祝,劉宏波,高長花,等. 石斛合劑序貫方基礎(chǔ)上運(yùn)用溫病理論指導(dǎo)加減治療糖尿病[J]. 中醫(yī)中藥,2014,12(15):274-275.

[16] 蘇曉燕,施紅,吳建珊,等. 石斛合劑序貫方不同劑型治療2型糖尿病臨床療效比較[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2015,30(6):2233-2235.

[17] Xu Q, Liu Y, Cong YB, et al. Gene expression and microarray investigation of dendrobium mixture as progressive therapy for the treatment of type 2 diabetes mellitus[J]. Tropical J Pharmaceutical Res, 2013,12(2):195-201.

福建省醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014-CX-29)。

施紅(E-mail: shihong3327@sina.com.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.012

R587.1

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1002-266X(2016)30-0039-04

2016-01-15)