唐坤龍，張春來，周洪霞，代艷楠，韓鳳超，尚小明，李月紅

(1華北理工大學(xué)，河北唐山063000；2唐山工人醫(yī)院)

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參芍口服液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

唐坤龍1，張春來2，周洪霞2，代艷楠1，韓鳳超1，尚小明2，李月紅2

(1華北理工大學(xué)，河北唐山063000；2唐山工人醫(yī)院)

目的觀察參芍口服液對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織炎癥因子Toll受體4(TLR4)及核因子κB(NF-κB)表達(dá)的影響，探討參芍口服液治療糖尿病腎病的機(jī)制。方法 將36只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組，每組各12只。模型組和治療組均予腹腔注射鏈脲佐菌素25 mg/kg制備糖尿病模型，空白組腹腔注射等劑量生理鹽水。造模后，治療組給予參芍口服液250 mg/(kg·d)灌胃，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均干預(yù)8周。于灌胃第12周末采集各組主動(dòng)脈血，檢測(cè)空腹血糖(FBG)、血Scr、血BUN；采集24 h尿液檢測(cè)24 h尿蛋白。取各組大鼠腎臟組織，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。采用免疫組化法、Western blot法檢測(cè)腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組FBG、血Scr、血BUN、24 h尿蛋白均高于空白組，治療組血Scr、血BUN、24 h尿蛋白均低于模型組(P均<0.05)。模型組腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)可見單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球、腎小管均可見纖維化改變；治療組腎小球及腎小管病理變化明顯輕于模型組。模型組腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)均高于空白組(P均<0.05)，治療組腎組織TLR4、NF-κB蛋白均低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論 參芍口服液可減輕糖尿病腎病大鼠的腎臟病理損傷、保護(hù)腎組織，其機(jī)制可能與下調(diào)腎組織TLR4及NF-κB表達(dá)有關(guān)。

參芍口服液；糖尿病腎病；炎癥；Toll受體；核因子κB

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥反應(yīng)與糖尿病腎病的發(fā)生有密切關(guān)系。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜蛋白，與免疫及炎癥反應(yīng)有關(guān)，是介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)的主體[2]。其中，TLR4在腎組織中表達(dá)較多。核因子κB(NF-κB)是眾多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在炎癥與免疫等病理生理過程中有重要作用[3]。TLR4/NF-κB通路在糖尿病腎病中的作用是目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，中藥可保護(hù)早期腎臟疾病患者的腎功能，有效延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[4]。參芍口服液是由唐山市工人醫(yī)院尚小明教授研發(fā)的中藥，主要成分為丹參、黃芪、紅花、水蛭、地龍等，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。2014年4月～ 2015年4月，我們對(duì)糖尿病腎病模型大鼠給予參芍口服液灌胃，觀察其對(duì)大鼠腎功能及腎組織TLR4、NF-κB表達(dá)的影響，為參芍口服液的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料雄性健康Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(0.21±0.15)kg，SPF級(jí)，購于由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鏈脲佐菌素購于美國Sigma公司；血糖儀、血糖試紙購于美國強(qiáng)生公司；免疫組化試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)有限公司；免疫印跡試劑盒購于上海碧云天生物有限公司；TLR4多克隆抗體購于北京博奧森公司；NF-κB 單克隆抗體試劑盒購于美國Abcam公司。

1.2分組及模型制備將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組，每組各12只。模型組和治療組均予腹腔注射鏈脲佐菌素25 mg/kg制備糖尿病模型，以第3、14天空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L且<30 mmol/L，并伴有多飲、多尿、多食為糖尿病模型造模成功。造模過程中模型組大鼠死亡2只，治療組死亡1只，均予剔除。空白組予腹腔注射等劑量的生理鹽水。

1.3干預(yù)方法造模后，治療組給予參芍口服液250 mg/(kg·d)灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均干預(yù)8周。

1.4空腹血糖(FBG)、腎功能指標(biāo)及24 h尿蛋白檢測(cè)于灌胃第12周末采集各組主動(dòng)脈血，檢測(cè)FBG、血Scr、血BUN。采集24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白。

1.5腎組織病理改變觀察取血、尿標(biāo)本后，將各組大鼠處死，取腎臟組織制作石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.6腎組織TLR4、NF-κB蛋白定性表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法。取各組石蠟切片于溫箱中脫蠟，枸櫞酸鈉行抗原修復(fù)1 min，分別加入一抗TLR4抗體(1∶150)或NF-κB抗體(1∶150)，DAB顯色。采用免疫組化圖像分析軟件分析結(jié)果，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達(dá)，測(cè)定其OD值作為蛋白表達(dá)量。

1.7腎組織TLR4、NF-κB蛋白半定量表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。取腎組織，將提取的蛋白滅活，加置電泳槽中電泳，采用濕轉(zhuǎn)的辦法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF，然后依次經(jīng)過封膜、孵育一抗、過夜、孵育二抗，將PVDF于生物凝膠圖像分析儀上進(jìn)行分析。用目的條帶與內(nèi)參的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組FBG、血Scr、血BUN及24 h蛋白尿比較模型組FBG、血Scr、血BUN、24 h尿蛋白均高于空白組，治療組血Scr、血BUN、24 h尿蛋白均低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組FBG、血Scr、血BUN及24 h蛋白尿比較

注： 與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2各組腎組織病理改變空白組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)未見異常。模型組可見腎小囊腔輕度狹窄，腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增生明顯，細(xì)胞外基質(zhì)可見單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球可見彌漫性和結(jié)節(jié)性硬化甚至纖維化，腎小管基底膜增厚，腎小管纖維化、增生、肥大。治療組腎小球及腎小管病理變化明顯輕于模型組。

2.3各組腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)比較模型組腎組織TLR4、NF-κB蛋白OD值及相對(duì)表達(dá)量均高于空白組(P均<0.05)，治療組腎組織TLR4、NF-κB蛋白OD值及相對(duì)表達(dá)量均低于模型組(P均<0.05)。見表2、圖1。

3　討論

糖尿病腎病主要表現(xiàn)為蛋白尿和腎功能異常，病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。免疫和炎癥機(jī)制是導(dǎo)致糖尿病腎病的重要原因。TLR是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)主要因子，主要存在于炎癥細(xì)胞及一些組織細(xì)胞[5]。其中，TLR4在腎小管上皮細(xì)胞、腎小球細(xì)胞尤其是退化的腎小管中表達(dá)較多[6]。在體外，高濃度葡萄糖可引起TLR4蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)[7]，并且激活TLR4信號(hào)通路，導(dǎo)致腎小球及腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)NF-κB依賴的炎癥反應(yīng)[8]。研究表明，STZ誘導(dǎo)的TLR4基因敲除的糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)輕、病理變化輕，表明TLR4可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)證明，糖尿病腎病患者腎組織TLR4蛋白表達(dá)較正常人高，TLR4表達(dá)與炎癥反應(yīng)程度、腎損傷及纖維化呈正相關(guān)，表明糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能與TLR4持續(xù)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此，抑制腎組織中TLR4的表達(dá)可能延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。

表2　各組大鼠腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)比較

注: 與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

注：1為空白組，2為模型組，3為治療組。

圖1各組腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況(Western blot法)

NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下與抑制因子結(jié)合后以一種不活潑的狀態(tài)存在，當(dāng)接受外界刺激或胞內(nèi)信號(hào)傳來時(shí)，該抑制物發(fā)生磷酸化，NF-κB與抑制物解離，隨后NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與特異性基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域κB序列結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[9]，進(jìn)而調(diào)控黏附分子、趨化分子、炎癥因子等多種細(xì)胞因子的表達(dá)。Pai等[10]證實(shí)，NF-κB表達(dá)異常伴隨糖尿病腎病始終。Liu等[11]證實(shí)，通過藥物降低NF-κB蛋白表達(dá)可延緩糖尿病腎病發(fā)展，提示抑制NF-κB活性可延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。

目前認(rèn)為，在糖尿病腎病發(fā)病過程中，TLR4/NF-κB通路發(fā)揮了重要作用。高糖、脂多糖、血糖波動(dòng)、高遷移率組蛋白1(HMGB1)等可刺激TLR4胞外區(qū)域激活TLR4，進(jìn)而激活一系列的炎癥因子，導(dǎo)致NF-κB抑制因子磷酸化，NF-κB被激活；活化的TLR4也可與β干擾素TRI結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)，激活一系列的炎癥因子，使NF-κB被激活。被激活的NF-κB可通過增加血管活性物質(zhì)(如內(nèi)皮-1和血管內(nèi)皮生長因子)表達(dá)、誘導(dǎo)iNOS表達(dá)、促進(jìn)t-PA表達(dá)、誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、血小板衍生化生長因子(PDGF)表達(dá)等機(jī)制，導(dǎo)致微血管病變、凝血功能障礙、趨化炎癥細(xì)胞等，導(dǎo)致腎小球肥大、腎小球高濾過、蛋白尿、促進(jìn)腎臟的纖維化硬化等，最終引起糖尿病腎損害[12～15]。激活的TLR4或TLR4蛋白表達(dá)量增加直接刺激免疫細(xì)胞和腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生有害的炎癥因子，加重腎組織損傷及炎癥，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展。多種炎癥因子形成正負(fù)反饋，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)，相互加強(qiáng)與抑制，最后造成腎臟的炎癥，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組腎臟組織細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球可見彌漫性和結(jié)節(jié)性硬化甚至纖維化，模型組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)高于空白組，提示糖尿病腎病大鼠的腎臟組織中TLR4、NF-κB表達(dá)增高，可能參與了腎組織纖維化病理過程。

參芍口服液是以活血化瘀、益氣通絡(luò)為本，用丹參、黃芪、紅花、水蛭、地龍等多味中草藥制成的中成藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，活血化瘀藥物具有多種生物活性，可改善外周血液循環(huán)，下調(diào)炎癥因子，含有多種還原成分清除氧自由基，具有減輕炎癥反應(yīng)、抗栓等多種作用[16]。參芍口服液還具有抗炎、降低炎癥因子表達(dá)的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組血Scr、血BUN、24 h尿蛋白均低于模型組，提示參芍口服液治療可降低糖尿病腎病大鼠的血糖水平、提高腎功能；治療組腎小球及腎小管病理變化明顯輕于模型組，提示參芍口服液可減輕糖尿病腎病大鼠的腎臟病理改變；治療組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)低于模型組，提示參芍口服液可降低腎組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)，具有抑制TLR4及NF-κB表達(dá)的作用，考慮參芍口服液可能通過抑制TLR4/NF-κB通路，從而減輕腎臟炎癥損害及病理損傷，從而延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

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張春來(E-mail: 120zcl@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.009

R587.2

A

1002-266X(2016)30-0031-03

2015-12-02)