曹凱，孟慶義，王瑞華，劉兆軒，王榮飛

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院)

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人Arresten基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

曹凱1，孟慶義2，王瑞華2，劉兆軒2，王榮飛2

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院)

目的構(gòu)建人Arresten基因的真核表達質(zhì)粒。方法 設(shè)計人Arresten基因引物序列，取100 mg新鮮的胎盤組織提取總RNA，采用RT-PCR 法擴增Arresten基因。將獲取的Arresten基因片段和pIRES2-EGFP質(zhì)粒分別用BamH Ⅰ和EcoRⅠ作雙酶切，將酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH-5α進行真核表達。采用酶切、菌液PCR及測序的方法檢測Arresten基因真核表達質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。結(jié)果 經(jīng)雙酶切鑒定，得到1條約700 bp的片段和1條與pIRES2-EGFP空載體(5.3 kb)相近的片段，符合Arresten基因重組質(zhì)粒大小。經(jīng)重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定，7組菌液均擴增出700 bp 大小的擴增片段，均為陽性克隆。測序結(jié)果示，Arresten基因mRNA與GenBank中人Arresten序列完全一致。結(jié)論 成功構(gòu)建了人Arresten基因的真核表達質(zhì)粒。

Arresten基因；表皮生長因子受體質(zhì)粒；真核；酶切；血管狹窄

血管移植術(shù)、血管腔內(nèi)成形術(shù)等血管重建術(shù)是目前治療冠狀動脈及外周動脈狹窄或閉塞性疾病的重要方法，但血管重建術(shù)后血管狹窄或再狹窄的發(fā)生率高達30%～50%，嚴(yán)重影響了遠期療效[1,2]。一旦血管重建術(shù)后血管內(nèi)再狹窄形成，就需要再次行血管移植術(shù)或血管內(nèi)支架置入術(shù)等手術(shù)治療。雖然國內(nèi)外學(xué)者對血管重建術(shù)后再狹窄的防治進行了大量研究，但目前臨床現(xiàn)有的藥物均未能有效降低血管重建術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生率[3]。因此，尋找有效的方法防治血管重建術(shù)后血管再狹窄已成為血管外科和心臟外科急需解決的研究課題之一。Arresten基因是Colorado等[4]發(fā)現(xiàn)的一種強效的血管生成抑制因子，屬于Ⅳ型膠原αⅠ鏈羧基端NCI結(jié)構(gòu)多肽片段，其DNA編碼序列長度為690 bp，相對分子量約為26 kD，在防治血管再狹窄方面具有廣闊的應(yīng)用前景。2014年9月～2015年7月，我們從健康產(chǎn)婦胎盤組織中提取總RNA，用 RT-PCR方法擴增出Arresten cDNA，構(gòu)建pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒，探討Arresten基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，為對其的進一步研究提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑胎盤組織由濟南市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，TRIzol試劑為Invitrogen產(chǎn)品。質(zhì)粒pIRES2-EGFP為Hanbio公司產(chǎn)品；大腸桿菌菌株DH-5α為Tiangen公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶和DNA Ladder Marker為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小、大量抽提試劑盒為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2Arresten基因引物設(shè)計與合成 根據(jù)唐海英等報道的Arresten基因克隆引物序列[5]設(shè)計引物，引物內(nèi)含有BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點。Arresten上游引物5′-GCCGAATTCATGTCTGTTGATCACGGC-3′，下游引物5′-GCGGATCCCTATTATTATGTTCTTCTC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3胎盤組織總RNA提取取100 mg新鮮的胎盤組織于液氮中，迅速研磨成粉末，加入TRIzol 1 mL混勻，室溫放置5 min，使其充分溶解。離心5 min后棄沉淀，加入氯仿0.2 mL，振蕩混勻后離心15 min。吸取上層水相，在其中加入異丙醇0.5 mL，混勻后放置10 min，離心棄上清，加入75%乙醇1 mL，離心后棄上清。室溫晾干后用20 μL RNase-free水溶解。

1.4Arresten基因擴增采用RT-PCR 法。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈，然后以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：5×PCR Buffer 10 μL，cDNA 2 μL，滅菌蒸餾水26.75 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Taq酶0.25 μL，總體積40 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收Arresten基因片段。

1.5pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將獲取的Arresten基因片段和pIRES2-EGFP質(zhì)粒分別用BamH Ⅰ和EcoRⅠ作雙酶切，酶切產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳及膠回收，回收產(chǎn)物與質(zhì)粒在T4DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH-5α。將含有重組質(zhì)粒的菌液平鋪于含有Ampicillin的LB瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選白色陽性克隆菌落，提取重組質(zhì)粒。

1.6鑒定方法 所得的重組質(zhì)粒作BamH Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，隨機挑取7個陽性菌落，瓊脂糖凝膠電泳后染色分析，凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。選取含有重組質(zhì)粒的陽性菌落，送至上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。將所得序列與GenBank中人Arresten序列進行比對。

2　結(jié)果

2.1人Arresten cDNA鑒定結(jié)果在約700 bp處擴增出一條特異性目的基因片段，與預(yù)計電泳結(jié)果大小相符。

2.2pIRES2-EGFP-Arresten重組表達質(zhì)粒鑒定結(jié)果BamH Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切后，得到1條約700 bp的片段和1條與pIRES2-EGFP空載體(5 300 bp)相近的片段，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

注：1為重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Arresten；2為重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Arresten雙酶切鑒定結(jié)果；M為DNA Marker。

圖1pIRES2-EGFP-Arresten酶切鑒定結(jié)果

2.3重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定結(jié)果7組菌液均擴增出700 bp 大小的擴增片段，均為陽性克隆。見圖2。

注：1～7為各陽性菌落；M為DNA Marker。

圖2重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定結(jié)果

2.4Arresten基因測序結(jié)果測序結(jié)果示，Arresten基因mRNA的長度為690 bp，與GenBank中人Arresten序列完全一致，表明目的基因正確插入質(zhì)粒pIRES2-EGFP中，pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3　討論

研究表明，血管重建術(shù)后血管狹窄或再狹窄的主要特征是血管內(nèi)膜增生。血管重建術(shù)后，炎癥反應(yīng)、組織損傷等多種因素共同激活細胞內(nèi)調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移的基因，最終導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖以及從血管中膜遷移到內(nèi)膜，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生，使血管腔狹窄或閉塞[6,7]。因此，血管平滑肌細胞的過度增殖并遷移至內(nèi)膜，是血管重建術(shù)后移植靜脈段發(fā)生再狹窄過程中的重要環(huán)節(jié)[8]。

基因治療是指將目的基因通過治療載體導(dǎo)入到病變部位，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病，已應(yīng)用于臨床治療中[9]。Arresten基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，在同等劑量下，Arresten抑制內(nèi)皮細胞增殖和血管生成的作用是血管內(nèi)皮抑素的3倍和10倍[4]。已有研究表明，Arresten可以有效抑制血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和血管管腔的形成[10]，可以作為防治血管移植術(shù)后再狹窄的靶基因。宋自芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Arresten重組蛋白可有效抑制血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移。因此，應(yīng)用Arresten基因治療血管重建術(shù)后再狹窄及閉塞性疾病具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

pIRES2-EGFP作為非病毒載體，具有易制備、低毒、無免疫原性、無致癌性等優(yōu)點[12]，能使目的基因蛋白充分表達，有效檢測其轉(zhuǎn)染效率，利于發(fā)揮基因的生物學(xué)活性，減少細胞毒性等優(yōu)勢，而且克服了單純應(yīng)用裸基因轉(zhuǎn)染效率低、易被溶酶體降解等弊端，符合基因治療的要求[13～15]。Arresten因子在胎盤組織中表達高，因此我們從健康產(chǎn)婦胎盤組織中提取總RNA，設(shè)計Arresten引物并在其兩端加入酶切位點，通過RT-PCR技術(shù)特異性擴增出目的基因，采用基因重組技術(shù)，將Arresten基因克隆入真核表達載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒。本研究中，通過對重組質(zhì)粒行酶切、菌液PCR鑒定，顯示pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，DNA測序證實重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，提示成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Arresten。本研究構(gòu)建的pIRES2-EGFP-Arresten重組質(zhì)粒為深入開展Arresten基因功能的研究和基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。

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Construction of eukaryotic expression plasmid of human Arresten gene

CAOKai1,MENGQingyi,WANGRuihua,LIUZhaoxuan,WANGRongfei

(1WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmid of Arresten gene. MethodsWe designed the human Arresten gene clone primer sequence. The total RNA was extracted from 100 mg fresh placenta tissues, and the Arresten gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The Arresten gene fragment and pIRES2-EGFP plasmid were digested with BamH I and EcoR I, respectively. The enzyme digestion product was connected with the plasmid, and transformed into E.coli DH-5α. The Arresten eukaryotic expression plasmid was identified with double enzyme digestion and colony-PCR and DNA sequencing. Results An about 700 bp fragment and a fragment similar to the pIRES2-EGFP empty plasmid (5.3 kb) were obtained by double enzyme digestion, which were consistent with the size of Arresten gene recombinant plasmid. Seven groups of bacteria all amplified about 700 bp amplified fragments, which were all positive clones after colony-PCR. The sequencing results showed that the mRNA gene and GenBank sequence were completely consistent. ConclusionThe eukaryotic expression plasmid of human Arresten gene was successfully constructed.

Arresten gene; epidermal growth factor receptor plasmid; eukaryotic; enzyme digestion; angiostenosis

曹凱(1989-)，男，碩士研究生，主要研究方向為基因治療血管移植后再狹窄的防治。E-mail: 1058968424@qq.com

簡介：孟慶義(1962-)，男，教授，主要研究方向為血管移植后再狹窄的防治。E-mail: 13370582128@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.007

R318.0

A

1002-266X(2016)30-0025-03

2016-01-09)