陳紅霞，曹霞，盧紅，汪蕾

(1湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗學(xué)院)

?

黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠的治療作用及機(jī)制探討

陳紅霞1，曹霞1，盧紅1，汪蕾2

(1湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗學(xué)院)

目的 探討黃芪多糖(APS)治療糖尿病心肌病(DCM)的機(jī)制。方法 選擇Wistar 大鼠50 只，其中30只腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型后，選擇其中20只隨機(jī)分為模型組、治療組各10只；其余20只未造模大鼠隨機(jī)分為空白對照組、APS組各10只。治療組及APS組予腹腔注射APS 300 mg/(kg·d)，空白對照組及模型組予腹腔注射等量生理鹽水。分別于第8、10、12、14周末取各組尾靜脈血檢測空腹血糖。于第14周末抽取腹主動脈血，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測血清IL-6、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平。取左心室肌組織，采用TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，計算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果 模型組各時點血糖水平均高于空白對照組(P均<0.05)，治療組第12、14周末血糖水平低于模型組(P均<0.05)。模型組血清IL-6、AngⅡ水平均高于空白對照組及治療組(P均<0.05)?？瞻讓φ战M、APS組、模型組、治療組AI分別為(1.47±0.34)、(1.38±0.56)、(62.56±11.32)、(31.05±8.75)個，模型組心肌細(xì)胞AI均高于空白對照組及治療組(P均<0.05)。結(jié)論 APS可降低糖尿病大鼠血清IL-6、AngⅡ水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，可能是其治療DCM的機(jī)制之一。

黃芪多糖；糖尿病心肌??；白細(xì)胞介素-6；血管緊張素Ⅱ；細(xì)胞凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的以心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為主，獨立于冠心病、高血壓、心肌擴(kuò)張病及其他心臟疾病的特異性心肌病變。研究表明，糖脂代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等在DCM的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在DCM的發(fā)病過程中，炎性因子的激活和腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAS)的活化發(fā)揮著重要的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在心血管疾病發(fā)病中，IL-6及血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是兩種非常重要的致冠狀動脈硬化、慢性心肌纖維化的危險因素[2～4]。AngⅡ可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成年和新生大鼠發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡[5～7]。因此，抑制IL-6釋放和AngⅡ?qū)π募〉膿p傷，對心血管疾病的預(yù)防具有重要意義。黃芪多糖(APS)是臨床上廣泛用于增強免疫功能的中藥制劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、降低血糖、改善脂代謝紊亂等作用[8]。 2015年 3～9月，我們對2型糖尿病模型大鼠給予APS治療，觀察其對血清IL-6、AngⅡ水平及心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討APS治療DCM的機(jī)制，為APS的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量180～250 g，由湖北科技學(xué)院實驗動物中心提供。其中30只大鼠給予高糖高脂飼料(在普通飼料的基礎(chǔ)上加入20%蔗糖和20%豬油)飼養(yǎng)，其余20只給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為恒溫(25 ±2)℃，相對濕度 52%～70%。

1.2藥物與試劑APS(純度為70%，另有少量黃芪皂苷、氨基酸及黃酮等)購自西安沃森生物科技有限公司，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物鑒定教研室鑒定。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；血糖試紙(強生中國醫(yī)療器材有限公司)；考馬斯亮藍(lán)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-6、AngⅡ ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3模型制備及分組所有大鼠飼養(yǎng)8周后，禁食12 h。對高糖高脂飼養(yǎng)大鼠給予一次性腹腔注射小劑量STZ 40 mg/kg制備糖尿病模型。糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)2次空腹血糖≥11.6 mmol/L。選取造模成功大鼠20只，隨機(jī)分為模型組、治療組各10只。以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)的20只大鼠不造模，隨機(jī)分為空白對照組、APS組各10只。

1.4干預(yù)方法治療組及APS組予腹腔注射APS 300 mg/(kg·d)，空白對照組及模型組予腹腔注射等量生理鹽水。各組大鼠繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)至14周。

1.5血糖水平檢測分別于第8、10、12、14周末取尾靜脈血檢測各組空腹血糖。

1.6血清IL-6、AngⅡ水平檢測采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法。于第14周末抽取腹主動脈血，3 000 r/min離心分離血清，檢測血清IL-6、AngⅡ水平，具體方法按照試劑盒說明操作。

1.7心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)測定第14周末取血后頸椎脫臼處死各組大鼠，取左心室肌組織制備常規(guī)石蠟切片。采用TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，光鏡下以細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡陽性細(xì)胞。隨機(jī)計數(shù)無重疊具有代表性的5個400倍視野，以平均每100個細(xì)胞核中含凋亡細(xì)胞個數(shù)作為AI[9]。

2　結(jié)果

2.1各組血糖水平比較模型組各期血糖水平均高于空白對照組(P均<0.05)，治療組第12、14周末的血糖水平低于模型組(P均<0.05)?？瞻讓φ战M與APS組各時間點血糖水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　各組第8、10、12、14周末血糖水平比較

注：與同時點空白對照組比較，*P<0.05；與同時點模型組比較，△P<0.05。

2.2各組血清IL-6、AngⅡ水平比較模型組血清IL-6、AngⅡ水平均高于空白對照組(P均<0.05)，治療組血清IL-6、AngⅡ水平均低于模型組(P均<0.05)?？瞻讓φ战M與APS組血清IL-6、AngⅡ水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2　各組血清IL-6、AngⅡ水平比較

注： 與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3各組心肌細(xì)胞凋亡情況空白對照組、APS組、模型組、治療組AI分別為(1.47±0.34)、(1.38±0.56)、(62.56±11.32)、(31.05±8.75)個，模型組心肌細(xì)胞AI高于空白對照組，治療組心肌細(xì)胞AI低于模型組(P均<0.05)。

3　討論

糖尿病是心血管疾病的高危因素。在急性冠脈綜合征等臨床事件中，糖尿病患者更容易發(fā)生心律失常、心力衰竭甚至猝死[10]。DCM是一種糖尿病特異性心肌病，也是糖尿病心肌病變發(fā)展的終末階段，其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥因子及心肌細(xì)胞凋亡均參與了DCM的發(fā)生發(fā)展[11]。

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，作用的靶細(xì)胞種類繁多，在感染和炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下釋放。在糖尿病或其他致心肌組織缺血或壞死疾病狀態(tài)下，大量炎性細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生大量的IL-6，參與了心臟病理變化的過程。研究表明，持續(xù)大量的IL-6會通過破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)心肌損傷和凋亡[12]。研究顯示，2型糖尿病患者血漿IL-6水平顯著高于正常人，提示IL-6可能參與DCM的發(fā)病[13]。

研究證實，在高血壓、冠心病、糖尿病、瓣膜病等致心力衰竭過程中，AngⅡ的分泌增加是導(dǎo)致患者心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)、心肌纖維化的重要機(jī)制[14]。在DCM的發(fā)生過程中，炎癥介質(zhì)IL-6的大量釋放，促進(jìn)了心肌損傷，此時的應(yīng)激狀態(tài)和心肌炎癥反應(yīng)激活RAS，參與了心肌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清IL-6、AngⅡ水平均高于空白對照組，模型組心肌細(xì)胞AI高于空白對照組，提示IL-6、AngⅡ在DCM心肌細(xì)胞凋亡中具有一定作用。

黃芪用藥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。APS是黃芪的主要活性成分之一，在黃芪中的含量為100～300 mg/g[15]。APS在臨床上可用作免疫調(diào)節(jié)劑，并有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激、抗氧化等作用。目前，APS在治療應(yīng)用方面主要涉及心血管疾病和抗腫瘤等疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可減輕糖尿病大鼠心臟氧化應(yīng)激和纖維化，減輕糖尿病造成的心肌損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組第12、14周末的血糖水平低于模型組，提示APS具有降血糖作用；治療組血清IL-6、AngⅡ水平均低于模型組，提示APS具有抗炎癥、抗氧化作用；治療組心肌細(xì)胞AI低于模型組，提示APS在抗糖尿病心肌細(xì)胞凋亡方面也有一定作用。

綜上所述，APS可降低糖尿病大鼠血清IL-6、AngⅡ水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，可能是其治療DCM的機(jī)制之一。

[1] 陳劍, 周瑞莉. 血管緊張素Ⅱ及轉(zhuǎn)化生長因子α在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用[J]. 嶺南心血管病雜志, 2012,18(3):246-248.

[2] Castoldi G, Gioia CD, Travaglini C, et al. Angiotensin Ⅱ increases tissue-specific inhibitor of metalloproteinase-2 expression in rat aortic smooth muscle cells in vivo: evidence of a pressure-independent effect[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2007,34(3):205-209.

[3] Huang Z, Wang C, Wei L, et al. Resveratrol inhibits EMMPRIN expression via p38 and ERK1/2 pathways in PMA-induced THP-1 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008,374(3):517-521.

[4] Guo RW, Yang LX, Wang H, et al. Angiotensin Ⅱ induces matrix metalloproteinase-9 expression via a nuclear factor-kappaB-dependent pathway in vascular smooth muscle cells[J]. Regulatory Peptides, 2008,147(1-3):37-44.

[5] Kajstura J, Cigola E, Malhotra A, et al. Angiotensin Ⅱ induces apoptosis of adult ventricular myocytes in vitro.[J]. J Mol Cell Cardiol, 1997, 29(3):859-870.

[6] Cigola E, Kajstura J, Li B, et al. Angiotensin Ⅱ activates programmed myocyte cell death in vitro.[J]. Exp Cell Res, 1997, 231(2):363-371.

[7] 周恒,唐其柱,鄧偉,等.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的新生小鼠心肌細(xì)胞肥大模型[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2015,44(11):26-30.

[8] 郭雪紅.黃芪注射液的藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國藥房,2015,26(21):3018-3021.

[9] 時俊，鄒云增，孫愛軍，等．氧化應(yīng)激在乙醛引起的心肌細(xì)胞凋亡中的作用[J]．中國病理生理雜志，2008，24(8)：1464-1468．

[10] Chavali V, Tyagi SC, Mishra PK. Predictors and prevention of diabetic cardiomyopathy.[J]. Diabetes Metab Syndr Obes, 2013,6:151-160.

[11] Liu JW, Liu D, Cui KZ, et al. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic cardiomyopathy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012,427(3):441-443.

[12] Torreamione G. Immune activation in chronic heart failure[J]. Am J Cardiol, 2005, 95(95):3-8.

[13] 邢茂娟, 袁志剛, 張海文,等. Visfatin、IL-6、TNF-α與2型糖尿病的相關(guān)研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11(24):4908-4911.

[14] Copaja SM, Valenzuela R, Saldana A, et al. Early expression of monocyte chemoattractant protein-1 correlates with the onset of isoproterenol-induced cardiac fibrosis in rats with distinctangiotensin-converting enzyme polymorphism[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2008, 9(3):154-162.

[15] 張艷賀,張雷鳴,劉秀波,等.不同產(chǎn)地黃芪中黃芪多糖的含量測定[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(5):69-71.

[16] 陳紅霞，曹霞，盧紅，等.黃芪多糖對糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2015,55(7):31-33.

Protective effect of Astragalus polysaccharides on myocardial inflammation of rat models with diabetic cardiomyopathy

CHENHongxia1,CAOXia,LUHong,WANGLei

(1BasicMedicalInstituteofHubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of Astragalus polysaccharide (APS) in the treatment of diabetic cardiomyopathy (DCM). MethodsFifty healthy male Wistar rats were selected, 30 of which were intraperitoneally injected with STZ to make the diabetic models, and 20 of them were randomly divided into the model group and the treatment group, each had 10 rats. The other 20 rats were randomly divided into the blank control group and the APS group, 10 in each. The treatment group and the APS group were administered with 300 mg/(kg·d) APS by intraperitoneal injection. The blank control group and model group were administered with the same amount of normal saline by intraperitoneal injection. At the end of week 8, 10, 12 and 14, we took the venous blood to test fasting blood-glucose. At the end of week 14, the blood from abdominal aorta was extracted, and using enzyme-linked immunoassay to detect the levels of serum IL-6 and Ang Ⅱ. The left ventricular muscle tissues were collected, and using TUNEL method to observe the myocardial apoptosis, and to calculate the myocardial apoptosis index (AI). Results The blood glucose levels in the model group at different periods were higher than those of the control group (allP<0.05), and the blood glucose level of the treatment group at the end of week 12 and 14 was lower than that of the model group (allP<0.05). The serum levels of IL-6 and Ang Ⅱ in the model group were higher than those of the blank control group and treatment group (allP<0.05). AI of the blank control group, APS group, model group and treatment group were respectively 1.47±0.34, 1.38±0.56, 62.56±11.32 and 31.05±8.75, and the myocardial cell AI in the model group were higher than those of the blank control group and treatment group (allP<0.05). Conclusion APS can reduce the serum levels of IL-6 and Ang Ⅱ in diabetes mellitus rat models and inhibiting the myocardial apoptosis may be one of the mechanisms in treatment of DCM.

Astragalus polysaccharide; diabetic cardiomyopathy; interleukin-6; Angiotensin Ⅱ; apoptosis

湖北省教育廳科學(xué)研究計劃資助項目(B2015085)。

陳紅霞(1978-)，女，碩士，講師，主要研究方向為心血管內(nèi)科、血栓與止血。E-mail: chx9701014@126.com

簡介：汪蕾(1979-)，女，博士，副教授，主要研究方向為心血管內(nèi)科、腫瘤免疫。E-mail: wl_5693@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.005

R587.2；R542.2

A

1002-266X(2016)30-0017-03

2015-12-04)