申甜，雷濤，徐碧林，章志建，張翠平

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，上海200062)

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西格列汀對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟IRS2/PI3K信號通路的影響

申甜，雷濤，徐碧林，章志建，張翠平

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，上海200062)

目的探討西格列汀對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟胰島素受體底物2(IRS2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路的影響。方法 取35只大鼠，應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)8周構(gòu)建NAFLD模型，取其中30只隨機分為二甲雙胍組、西格列汀組、模型組各10只，分別以二甲雙胍500 mg/(kg·d)、西格列汀10 mg/(kg·d)、等體積生理鹽水灌胃8周。另取5只未造模大鼠作為對照組，以等體積生理鹽水灌胃8周。各組干預(yù)后，腹主動脈采血，檢測血清空腹血糖(FBG)、肝功能指標(biāo)(包括ALT、AST)、血脂指標(biāo)(包括TC、TG)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清FINS水平，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。取出肝臟稱重，計算肝指數(shù)(肝臟濕重/體質(zhì)量)。制備肝臟勻漿，檢測肝臟TG水平。取肝右葉組織行HE染色，觀察肝細胞脂肪變性程度、炎性活動度及肝纖維化程度。采用RT-PCR法檢測肝組織IRS2 mRNA表達，采用Western blot法檢測肝組織PI3K-p85α蛋白表達。結(jié)果 模型組肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝臟TG 水平均高于對照組(P均<0.05)；二甲雙胍組及西格列汀組肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝臟TG 水平均低于模型組(P均<0.05)；西格列汀組HOMA-IR及肝臟TG 水平均低于二甲雙胍組(P均<0.05)。模型組肝組織見大量炎癥細胞浸潤，肝細胞出現(xiàn)明顯的小泡性脂肪變性；二甲雙胍組肝細胞空泡樣變及細胞質(zhì)疏松化較模型組減輕；西格列汀組以上病理改變較二甲雙胍組減輕。與模型組相比，西格列汀組及二甲雙胍組IRS2 mRNA表達增加、PI3K-p85α蛋白表達降低(P均<0.05)。西格列汀組IRS2 mRNA表達高于二甲雙胍組、PI3K-p85α蛋白表達低于二甲雙胍組(P均<0.01)。結(jié)論 西格列汀可明顯改善高脂誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟脂肪沉積及IR，其機制可能與調(diào)節(jié)肝臟IRS2/PI3K信號通路有關(guān)。

二甲雙胍；西格列??；非酒精性脂肪肝；胰島素；胰島素受體底物2；磷脂酰肌醇3-激酶

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種無過量飲酒史，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD患者常存在周圍組織和肝臟的胰島素抵抗(IR)[1]，且IR的嚴重程度與NAFLD的病情進展相關(guān)[2,3]。肝細胞胰島素受體底物2(IRS2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路異常是導(dǎo)致IR的最主要原因，IRS2(-/-)可致外周IR及肝臟抵抗。p85α是PI3K調(diào)解亞基，其過度表達可下調(diào)PI3K活性而干擾IRS2/PI3K的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。新型降糖藥物西格列汀是二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)抑制劑，除發(fā)揮降糖作用外，還有良好的降脂及改善IR作用。2015年6～12月，我們對高脂誘導(dǎo)的NAFLD大鼠予以西格列汀灌胃干預(yù)，以傳統(tǒng)降糖藥物二甲雙胍為對照，探討西格列汀對NAFLD大鼠肝臟IRS2及PI3K-p85α表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑健康清潔級6～8周齡雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量(180±10)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。高脂飼料(成分為83%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽)由上海斯萊克實驗動物有限公司生產(chǎn)。鹽酸二甲雙胍(500 mg/片)購自上海施貴寶制藥公司；西格列汀(100 mg/片)由默沙東公司饋贈；胰島素及肝臟TG試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑 PrimeScript RT購自Thermo公司；熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqⅡ購自日本TaKaRa Bio株式會社；兔抗人PI3K-p85α抗體ab40775 abcam、預(yù)染蛋白Marker購自Thermo公司。

1.2NAFLD造模方法大鼠以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，再應(yīng)用高脂飼料喂養(yǎng)8周構(gòu)建NAFLD模型。造模后隨機抽取5只模型組大鼠，經(jīng)稱重、檢測血糖血脂等生化學(xué)指標(biāo)及行肝組織病理檢測，以體質(zhì)量及肝臟濕質(zhì)量明顯增加，血空腹胰島素(FINS)、穩(wěn)態(tài)胰島素評價指數(shù)(HOMA-IR)明顯升高，血脂指標(biāo)(包括TC、TG)及肝功能指標(biāo)(包括ALT、AST)明顯升高，肝臟病理組織學(xué)示肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)細胞腫脹、胞核消失或脂肪空泡，為NAFLD造模成功。

1.3動物分組及干預(yù)方法將NAFLD造模成功大鼠按隨機數(shù)字表法分為二甲雙胍組、西格列汀組、模型組各10只，分別以二甲雙胍500 mg/(kg·d)、西格列汀10 mg/(kg·d)、等體積生理鹽水灌胃8周。另取同齡5只未造模大鼠作為對照組，以等體積生理鹽水灌胃8周。

1.4肝指數(shù)、血糖、肝功能、血脂及肝臟TG水平檢測 干預(yù)8周后，各組于末次給藥后，禁食12 h，行乙醚腹腔麻醉，稱重。腹主動脈采血，分離血清后，迅速取出肝臟并稱重，計算肝指數(shù)=肝臟濕重/體質(zhì)量。采用日本Olympus公司AU2700型全自動生化檢測儀,檢測血清空腹血糖(FBG)、肝功能指標(biāo)(包括ALT、AST)、血脂指標(biāo)(包括TC、TG)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清FINS水平，計算HOMA-IR。以氯仿：甲醇(2∶1)的比例制備肝臟勻漿，應(yīng)用TG測定試劑盒檢測肝臟TG水平。

1.5肝組織病理學(xué)觀察取肝右葉組織約2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm制備石蠟切片，行HE染色，觀察肝細胞脂肪變性、炎性改變及肝纖維化情況。

1.6肝組織IRS2 mRNA表達檢測采用RT-PCR法。TRIzol法抽提大鼠肝臟總RNA，按SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物設(shè)計和合成： IRS2基因序列均從GenBank中獲取，引物用Primer5.0軟件進行設(shè)計： IRS2上游5′-ATCGATGGCCTTCTCTCTCCA-3′，下游5′-ATCGATGGCCTTCTCTCTCCA-3′；GAPDH上游5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s、60 ℃ 34 s共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，ABI7300 SDS Software自動分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參基因，對所有樣品進行規(guī)一化處理，ΔCt為目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值，以2-ΔΔCt為目的基因相對表達量。

1.7肝組織PI3K-p85α蛋白表達檢測采用Western blot法。將少許肝組織裂解、離心、提取核蛋白，預(yù)先甲醇處理PVDF膜，然后將膜貼于凝膠上，在100 V電壓下轉(zhuǎn)印。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，加入稀釋好的PI3K-p85α一抗抗體，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加入稀釋好的兔抗大鼠IgG二抗抗體(1∶5 000)，振蕩孵育。使用超敏化學(xué)發(fā)光液在暗示中處理，看到熒光后用感光膠片按壓，顯影、定影后，用Image Plus Pro 6.0系統(tǒng)測定灰度值。

2　結(jié)果

2.1各組肝指數(shù)、血糖、肝功能、血脂及肝臟TG水平比較模型組肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝臟TG 水平均高于對照組(P均<0.05)；二甲雙胍組及西格列汀組的肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝臟TG 水平均低于模型組(P均<0.05)；西格列汀組HOMA-IR及肝臟TG 水平均低于二甲雙胍組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組肝指數(shù)、血糖、肝功能、血脂及肝臟TG水平比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與二甲雙胍組比較，△P<0.05。

2.2肝組織病理學(xué)觀察模型組肝組織呈漁網(wǎng)狀，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見大量以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，肝細胞出現(xiàn)明顯的小泡性脂肪變性，細胞水腫，出現(xiàn)較多氣球樣變；所有標(biāo)本均未見肝纖維化。二甲雙胍組肝小葉結(jié)構(gòu)有少量紊亂，但肝細胞空泡樣變及細胞質(zhì)疏松化較模型組略有減輕，未見肝細胞壞死。西格列汀組病理改變較二甲雙胍組減輕。

2.3各組肝組織IRS2 mRNA 、PI3K-p85α蛋白表達比較 與模型組相比，西格列汀組及二甲雙胍組IRS2 mRNA表達增加、PI3K-p85α蛋白表達降低(P均<0.05)，西格列汀組IRS2 mRNA表達高于二甲雙胍組、PI3K-p85α蛋白表達低于二甲雙胍組(P均<0.01)。見表2。

表2　各組肝組織IRS2 mRNA及PI3K-p85α蛋白表達比較±s)

注：與模型組比較，#P<0.05；與二甲雙胍組比較，*P<0.05。

3　討論

近年來，NAFLD發(fā)病率逐年增高且呈年輕化趨勢，我國成年人NAFLD的患病率達9.4%～33.5%，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾病[4]。因此，了解關(guān)于NAFLD發(fā)病機制，對延緩脂肪肝的進展有重要意義。NAFLD具有復(fù)雜的遺傳背景和環(huán)境因素，主要發(fā)病機制至今尚未完全明確，其中二次打擊學(xué)說[5]被認為是目前解釋NAFLD發(fā)病機制最成熟的學(xué)說。以IR為中心環(huán)節(jié)導(dǎo)致的肝細胞脂肪變性、肝臟脂肪沉積是NAFLD發(fā)病中的首次打擊，而在此基礎(chǔ)上發(fā)生的、以線粒體反應(yīng)氧體系為核心的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化對肝臟的損傷是NAFLD發(fā)病的第二次打擊。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組HOMA-IR、ALT、AST、TG、TC、肝臟TG均高于對照組，肝組織出現(xiàn)明顯的小泡性脂肪變性、細胞水腫、氣球樣變、局部炎性浸潤，提示NAFLD大鼠出現(xiàn)明顯的IR、肝功能障礙及肝臟TG沉積，肝細胞出現(xiàn)脂肪變性及部分炎癥改變。

IR引起NAFLD的主要原因是脂代謝紊亂和高胰島素血癥，但確切病理機制尚不完全清楚。胰島素與其受體α亞基結(jié)合，使β亞基酪氨酸激酶活化，進而使胰島素敏感組織細胞內(nèi)的胰島素受體底物(IRS)磷酸化，從而誘發(fā)一系列生化改變[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IRS2/PI3K信號通路在維持正常生理作用胰島素與其相應(yīng)受體結(jié)合的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[7]。

IRS-2是IRS家族成員之一，為IRS2/PI3K途徑上游的重要轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟和胰島β細胞中大量表達。IRS-2基因表達降低或基因敲除后，蛋白質(zhì)表達量減少或功能障礙會影響胰島素信號的有效傳遞，導(dǎo)致IR的發(fā)生。除IRS2之外，其通路中還包括PI3K、AKT和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)等多個關(guān)鍵分子。PI3K-p85α是一個分子量為85 kD的PI3K調(diào)解亞基，其過度表達能夠競爭性抑制p85-p110二聚體與胰島素受體底物IRS的結(jié)合，從而抑制PI3K的活性[8]。P85α過度表達是誘導(dǎo)IR出現(xiàn)的一個早期分子步驟[9]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠p85基因使p85α表達下調(diào)后，可明顯改善IR。實驗證實，在IR大鼠中，肝臟、肌肉組織中PI3K的表達均明顯減少或消失，提示IRS2/PI3K信號通路在IR發(fā)生中發(fā)揮重要作用[10～16]。高脂飼養(yǎng)可導(dǎo)致成年大鼠體內(nèi)IRS2/PI3K信號通路傳導(dǎo)減弱，出現(xiàn)IR[17]。

作為新型的降糖藥物DPP-4抑制劑西格列汀，可通過選擇性抑制DPP-4而減少胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)降解，延長GLP-1作用時間，具有促進胰島素分泌、降低血糖及改善胰島功能的作用。臨床研究表明，對合并NAFLD的2型糖尿病患者使用DPP-4抑制劑單藥或聯(lián)合干預(yù)治療后，在血糖控制較理想的同時，血脂、肝功能也有較明顯的改善。Shirkawa等[18]研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠具有較好的療效，可降低HOMA-IR、肝組織SREBP-1 /PPARα比值、肝內(nèi)脂肪含量，可能與西格列汀干預(yù)后使肝內(nèi)脂肪酸合成減少、氧化分解代謝增強有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，西格列汀組肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、ALT、AST、TC、TG及肝臟TG 水平均低于模型組，西格列汀組HOMA-IR及肝臟TG 水平均低于二甲雙胍組，提示西格列汀可降低NAFLD大鼠的肝指數(shù)、FBG、HOMA-IR、血清ALT、AST、TG、TC、FBG水平，且西格列汀改善肝臟脂肪變性及減少肝臟TG的作用優(yōu)于二甲雙胍；與模型組相比，西格列汀組及二甲雙胍組IRS2 mRNA表達增加、PI3K-p85α蛋白表達降低，西格列汀組IRS2 mRNA表達高于二甲雙胍組、PI3K-p85α蛋白表達低于二甲雙胍組，提示西格列汀可能通過改善IRS2/PI3K信號通路的下游分子傳導(dǎo)，減少游離脂肪酸在肝臟的堆積，減輕肝細胞脂肪變及肝臟IR的發(fā)生，從而抑制NAFLD進展。

綜上所述，NAFLD大鼠肝臟出現(xiàn)IRS2/PI3K信號通路異常改變，西格列汀可上調(diào)IRS2 mRNA及抑制PI3K-p85α蛋白表達，改善IRS2/PI3K信號通路，從而改善IR及逆轉(zhuǎn)肝臟脂質(zhì)沉積，且效果優(yōu)于二甲雙胍。

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Influence of sitagliptin on IRS2/PI3K signal pathway in liver tissues of NAFLD rats

SHENTian,LEITao,XUBilin,ZHANGZhijian,ZHANGCuiping

(ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai200062,China)

ObjectiveTo explore the effect of sitagliptin on liver insulin receptor substrate-2/phosphatidylinositol 3-kinase (IRS2/PI3K) signal pathway in rats with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsThirty-five SD rats were selected to establish NAFLD models by 8-week high-fat diet feeding, after that 30 NAFLD rats were chosen and were divide into 3 groups: the metformin group, sitagliptin group and model group which were treated with 500 mg/( kg/d) metformin, 10 mg/( kg/d) sitagliptin and equal volume of saline by gavage for 8 weeks. Meanwhile, another 5 rats were treated with normal saline as the control group. Blood samples were obtained from abdominal aorta after 8-week treatment, the fasting blood-glucose (FBG), ALT, AST, TC, TG and insulin (FINS) level were measured by ELISA method, and the homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) index was calculated. We took out the liver, weighed and calculated the liver index (liver wet weight/body mass). Liver homogenate was prepared to detect TG level in liver. HE staining was carried out to observe the degree of liver fatty degeneration, inflammatory activity and degree of hepatic fibrosis. IRS2 mRNA was measured by using RT-PCR and the expression level of PI3K-p85α was determined by Western blotting. ResultsThe liver index, FBG, HOMA-IR, ALT, AST, TC, TG and liver TG level were higher in the model group than those of the control group (allP<0.05). The liver index, FBG, HOMA-IR, ALT, AST, TC, TG and liver TG content were reduced significantly in the metformin and sitagliptin groups as compared with those of the model group (allP<0.05). What′s more, the HOMA-IR and hepatic TG content of the sitagliptin group was lower than that of the metformin group (allP<0.05). In the model group, there was a large amount of inflammatory cell infiltration in hepatic tissues and microvesicular fatty degeneration in the hepatocytes. The hepatic cell vacuolar degeneration and cytoplasm osteoporosis of the metformin group were alleviated as compared with thsoe of the model group. The pathological change was relieved in the sitagliptin group as compared with that of the metformin group. Compared with the model group, the expression of IRS2 mRNA was increased and PI3K-p85α protein was decreased significantly in the sitagliptin and metformin groups (allP<0.05). IRS2mRNA expression was higher and PI3K-p85α protein expression was lower in the sitagliptin group than that of the metformin group, respectively (allP<0.01).ConclusionSitagliptin could significantly improve the liver pathological changes and liver TG contents of NAFLD rats induced by high-fatty diet, and the mechanism could be related with adjusting the signal pathway of IRS2/PI3K in the liver.

metformin; sitagliptin; non-alcoholic fatty liver disease; insulin receptor substrate-2; phosphatidylinositol 3-kinase

上海市衛(wèi)生局青年科研項目(2013Y079)；上海市中醫(yī)藥大學(xué)后備業(yè)務(wù)專家培養(yǎng)計劃項目(B-X-79)。

申甜 (1980-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為肥胖及胰島素抵抗。E-mail: shentian2017@163.com

簡介：雷濤(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為脂代謝紊亂。E-mail: leitao5899@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.004

R587.1

A

1002-266X(2016)30-0013-04

2016-03-31)