李鞠，唐鳳英

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210000；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院)

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·論著·

原發(fā)性腎病綜合征患者血清異常代謝通路的代謝組學(xué)分析

李鞠1，2，唐鳳英2

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南京210000；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院)

目的 通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)方法，分析與原發(fā)性腎病綜合征(PNS)相關(guān)的異常代謝通路，探討PNS的發(fā)病機(jī)制。方法 應(yīng)用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法方法對(duì)40例PNS患者(觀察組)和40 例健康體檢者(對(duì)照組)血清樣本中的代謝物進(jìn)行檢測(cè)，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法進(jìn)行模式識(shí)別，構(gòu)建PNS診斷模型，采用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路分析。結(jié)果 OPLS-DA模型的質(zhì)量參數(shù)R2X=71.4%，Q2Y=0.517，觀察組、對(duì)照組間的區(qū)分非常明顯。代謝通路分析共篩選出有差異的代謝物相關(guān)通路9個(gè)，其中硫胺素代謝、嘧啶代謝、苯基丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)4個(gè)代謝通路影響值均大于0.1。結(jié)論 PNS患者存在硫胺素代謝、嘧啶代謝、苯基丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)代謝紊亂，可能與PNS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

代謝組學(xué)；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；原發(fā)性腎病綜合征；代謝通路；通路分析

原發(fā)性腎病綜合征(PNS)是成人最常見的腎小球疾病，其病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要原因。約90%的PNS病因不明。隨著基因研究的不斷深入及系列組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)腎臟疾病病因的研究已從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)方面[1,2]。PNS受遺傳、環(huán)境和局部組織因子等多因素影響，明確不同患者在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或蛋白質(zhì)代謝等多方面的差異，有助于對(duì)PNS的精確診斷。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)是一種較新的代謝組學(xué)分析方法，對(duì)樣本溫度要求較低，對(duì)待測(cè)樣品的揮發(fā)性沒有太高要求[3]。2012～2014年，我們采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(UPLC-HRMS)的LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)40例PNS患者的血清異常代謝通路進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)建立PNS患者血清代謝物的診斷模型，探討PNS患者存在的代謝組學(xué)異常代謝通路，以進(jìn)一步了解PNS的發(fā)生機(jī)制，為其治療提供新的靶點(diǎn)。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年12月～2014年10月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院治療的PNS患者40例為觀察組，男18例、女22例，年齡(31.38±11.28)歲，均為初診，均伴有程度不同的雙下肢浮腫，血清白蛋白(25.72±6.91)g/L，TG(2.09±0.62)mmol/L，24 h尿蛋白(6.65±3.23)g。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Hull等[4]2008年提出的PNS診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者未經(jīng)激素及免疫抑制劑治療，無(wú)其他系統(tǒng)合并癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性腎病綜合征，如狼瘡性腎炎、糖尿病腎病、過(guò)敏性紫癜腎病等；②合并明顯的肝、腦、心、肺、血液等系統(tǒng)疾??；③近2周內(nèi)發(fā)生呼吸道感染；④接受激素及免疫抑制劑藥物治療。選取同期在南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院體檢的健康志愿者40例為對(duì)照組，男20例、女20例，年齡(34.21±9.62)歲。所有患者簽署知情同意書，符合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2主要儀器 UPLC Ultimate 3000 System Dionex串聯(lián)Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo 公司)；Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(長(zhǎng)度100 mm，油管內(nèi)徑2.1 mm， 顆粒直徑1.9 μm，美國(guó)Thermo公司)；色譜純乙腈(德國(guó)Merck公司)；色譜純乙酸銨(美國(guó)Tedia公司)；XW-80A型渦旋混合器(原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；離心濃縮干燥儀(美國(guó)Labconco公司)。

1.3UPLC-HRMS分析方法

1.3.1標(biāo)本采集采集兩組清晨空腹靜脈血5 mL，靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液500 μL，放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.2UPLC-HRMS分析取待測(cè)血清10 μL，加入甲醇90 μL，沉淀蛋白質(zhì)，冷凍離心機(jī)離心，將上清液轉(zhuǎn)移至EP管，在Labconco離心濃縮干燥儀中濃縮至干，用20 μL純甲醇復(fù)溶渦旋30 s，轉(zhuǎn)移至100 μL玻璃內(nèi)襯管，將內(nèi)襯管放置入1.5 mL棕色進(jìn)樣瓶，4 ℃冰箱保存。采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱進(jìn)行色譜分離及代謝組學(xué)分析。色譜柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，流速為0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，95%A；1～15 min，95%A～40%A；15～16 min，40%A～5%A；16～17 min，5%A；17～18 min，5%A～95%A；18～20 min，95%A。質(zhì)譜條件：電噴霧電壓正離子掃描為3.5 kV，負(fù)離子掃描為-2.5 kV，離子傳輸管溫度為250 ℃，鞘氣體流為50 arb，輔助氣體流量為13 AU，尾氣為0 AU，管透鏡電壓為60 V。在Full-ms模式下同時(shí)進(jìn)行正、負(fù)離子掃描，掃描范圍m/z為70～1 050 Da，最大注射時(shí)間為30 ms。

1.4PNS診斷模型構(gòu)建利用SIEVE軟件處理色譜、質(zhì)譜結(jié)果的原始數(shù)據(jù)，構(gòu)建PNS診斷模型。保存處理過(guò)程產(chǎn)生的二維矩陣表，包括標(biāo)注的峰序號(hào)(RT-m/z)、樣品名稱和每個(gè)樣品的峰面積。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存的包含400多種小分子代謝產(chǎn)物的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)，通過(guò)比對(duì)保留時(shí)間及精確分子量對(duì)待測(cè)代謝物進(jìn)行定性分析，通過(guò)比對(duì)峰面積對(duì)待測(cè)代謝物進(jìn)行定量分析。對(duì)于代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫(kù)不能鑒別的峰，以分子質(zhì)量±0.001的誤差為標(biāo)準(zhǔn)，搜索人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)進(jìn)行鑒定。采用SIMCA-P11.0軟件包對(duì)各組患者的血漿代謝組分進(jìn)行判別分析，數(shù)據(jù)采用Pareto標(biāo)度化進(jìn)行預(yù)處理后，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法對(duì)血漿代謝物進(jìn)行分析，得到OPLS-DA散點(diǎn)分布圖，建立PNS診斷模型。

1.5差異代謝物相關(guān)通路分析 將兩組差異代謝物輸入MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)，測(cè)定差異代謝物與HMDB、PubChem和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配情況。指定路徑分析通過(guò)路徑庫(kù)、通路富集分析算法和拓?fù)浞治鏊惴ㄟM(jìn)行，選擇Homo sapiens(human)即人類通路為通路路徑庫(kù)，獲得各通路相關(guān)代謝物的影響因子值，行通路富集和拓?fù)浞治?。將代謝通路影響因子值的臨界點(diǎn)設(shè)置為0.1，以高于0.1為差異代謝物相關(guān)通路。

2　結(jié)果

2.1PNS診斷模型結(jié)果分析OPLS-DA模型的質(zhì)量參數(shù)R2X=71.4%，Q2Y=0.517，觀察組與對(duì)照組沿第一主成分橫軸方向能明顯分開，僅有個(gè)別樣品交叉和重疊，分離趨勢(shì)明顯,二者在小分子代謝物方面差異明顯。見插頁(yè)Ⅰ圖1。

2.2差異代謝物相關(guān)通路共篩選出有差異的代謝物相關(guān)通路9個(gè)，其中硫胺素代謝、嘧啶代謝、苯基丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)代謝通路的影響值均大于0.1。見表1、插頁(yè)Ⅰ圖2。

表1　PNS患者血清差異代謝物相關(guān)通路分析結(jié)果

注：“Total”表示該代謝途徑中所有代謝物個(gè)數(shù)；“Expected”表示差異代謝物所占比例；“Hits”表示篩選出的差異代謝物在該代謝途徑中的個(gè)數(shù)；“RawP”表示富集分析的原始計(jì)算P值；“HolmP”表示富集分析時(shí)采用Holm-Bonferroni統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的P值(主要目的是抵消多重比較誤差)； “FDRP”表示多重檢驗(yàn)中的FDR錯(cuò)誤控制P值；“Impact”表示路徑拓?fù)浞治鲇?jì)算出的影響值。

3　討論

代謝組學(xué)是通過(guò)檢測(cè)體內(nèi)小分子化合物的水平變化，從而發(fā)現(xiàn)機(jī)體基礎(chǔ)代謝的變化特點(diǎn)，反映機(jī)體在病理、生理刺激或基因修飾下產(chǎn)生的代謝物動(dòng)態(tài)變化，從而為研究代謝性疾病的發(fā)病過(guò)程和發(fā)病機(jī)制提供診斷依據(jù)。近年來(lái)，代謝組學(xué)為多種疾病的診斷和治療提供了一種新的方法。目前，代謝組學(xué)已應(yīng)用于急性腎損傷、常染色體顯性遺傳多囊腎及腎癌等腎臟疾病生物標(biāo)志物的檢測(cè)[5]。在PNS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，由于體液、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，大量免疫球蛋白從尿中丟失，部分血清免疫球蛋白和補(bǔ)體C3水平下降，血脂代謝紊亂，患者可出現(xiàn)低白蛋白、高脂血癥及免疫調(diào)節(jié)因子異常等代謝異常狀態(tài)。因此，對(duì)PNS患者進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，可通過(guò)分析異常代謝物，明確患者血液中存在的受干擾代謝通路，有助于從代謝層面上進(jìn)一步了解PNS的發(fā)病過(guò)程及個(gè)體化治療的進(jìn)行。

UPLC-HRMS技術(shù)具有靈敏度高和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可通過(guò)高分辨質(zhì)譜全掃描模式提取目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)，利用閾值自動(dòng)觸發(fā)全掃描二級(jí)質(zhì)譜，在一定程度上消除了基質(zhì)干擾，且樣品前處理方式較為簡(jiǎn)單，可同時(shí)快速篩選和確證血清中的部分小分子代謝物。OPLS-DA是將正交信號(hào)校正方法與偏最小二乘法結(jié)合并對(duì)偏最小二乘法(PLS)進(jìn)行修正的分析方法，可以濾過(guò)與反應(yīng)沒有直接關(guān)系的變化，生成的結(jié)果更清晰、更易于解釋，在代謝組學(xué)研究中的判別能力優(yōu)于主成分分析法(PCA)和簡(jiǎn)單獨(dú)立建模級(jí)類推法(SIMCA)等方法。OPLS是常用的有監(jiān)督模式識(shí)別方法，通過(guò)將正交信號(hào)校正方法(OSC)與PLS相結(jié)合，以樣本的類別作為反應(yīng)變量(Y)建立一個(gè)PLS模型，獲得與Y不相關(guān)的自變量(X)信息，將其去除，從而提高模式識(shí)別方法的判別能力。采用OPLS-DA分析方法可最大化凸顯疾病組和健康人群的組間差異，獲得更好的組間分類效果。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用UPLC-HRMS技術(shù)檢測(cè)后得出的OPLS-DA得分圖對(duì)觀察組、對(duì)照組間的區(qū)分非常明顯，提示PNS患者與健康對(duì)照者間的代謝物存在明顯不同，有助于區(qū)分PNS患者與健康者。

蛋白質(zhì)分解代謝的加強(qiáng)及炎癥狀態(tài)下能量需求的增加是PNS患者出現(xiàn)氨基酸代謝紊亂的主要原因。給予腎病綜合征患者低蛋白飲食，補(bǔ)充必需氨基酸(EAA)后，能夠改善患者體內(nèi)EAA比例失調(diào)狀態(tài)，提高EAA的可利用度，增加蛋白質(zhì)的合成[6]。苯基丙氨酸屬于EAA，需要從食物中攝取。腎病綜合征患者EAA代謝異常與其蛋白質(zhì)攝取率及降解為氨基酸時(shí)的釋放率低有關(guān)。

檸檬酸反映腎小管細(xì)胞功能[7]，其吸收及分泌受腎臟調(diào)節(jié)[8,9]，酸中毒狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)ATP檸檬酸合酶的變化同樣影響檸檬酸的排出。PNS患者容易合并腎小管功能異常，主要以近曲小管重吸收受損及遠(yuǎn)曲小管泌酸障礙為主，Ⅰ型和Ⅱ型腎小管酸中毒均可出現(xiàn)，進(jìn)而影響患者體內(nèi)的檸檬酸代謝通路。

硫胺素是維生素B1，具有增進(jìn)食欲、維持神經(jīng)正?；顒?dòng)的作用。硫胺酸缺乏可能是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)因素[10]。Luong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充硫胺素可以改善糖尿病的微血管和大血管并發(fā)癥。而以往報(bào)道[12]，腎病綜合征患者血硫胺素水平與正常人群相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與研究的樣本量較小有關(guān)。

嘧啶衍生物構(gòu)成人體核苷酸中的含氮堿(堿基)。腎病綜合征患者多存在脂質(zhì)代謝紊亂，嘧啶代謝中的胞嘧啶與脂類中某些鞘脂的合成密切相關(guān)，并可造成蛋白激酶C(PKC)活化，進(jìn)一步加重腎臟的損害。以往研究表明，腎病綜合征患者存在嘧啶及嘌呤核苷酸代謝異常，這也成為很多免疫抑制劑的治療靶點(diǎn)[13,14]。

本研究利用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出所有差異代謝物的相關(guān)代謝通路，通路分析結(jié)果提示PNS患者苯基丙氨酸代謝、檸檬酸代謝、硫胺素代謝、嘧啶代謝影響值大于0.1，提示PNS患者存在明顯的苯基丙氨酸代謝、檸檬酸代謝、硫胺素代謝、嘧啶代謝通路紊亂，涉及氨基酸、碳水化合物、核苷酸代謝及能量轉(zhuǎn)化和基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程，可能與PNS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，推測(cè)PNS代謝紊亂的中心環(huán)節(jié)可能是核苷酸、檸檬酸代謝紊亂，從而使相關(guān)苯基丙氨酸、支鏈氨基酸代謝等紊亂，進(jìn)而發(fā)生血脂、蛋白質(zhì)及水電解質(zhì)異常。

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Metabolomics analysis of disturbed metabolic pathways involved in serum of patients with primary nephrotic syndrome

LIJu1,TANGFengying

(1TheFirstAffiltatedHospitalof,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210000,China)

ObjectiveTo analyze the disturbed metabolic pathways associated with primary nephrotic syndrome (PNS) by liquid chromatography/mass spectrometry metabolomics method in order to explore the pathogenesis. MethodsUltraperformance liquid chromatography tandem quadrupole Q Exactive-Orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q Exactive HRMS) method was used in 40 cases of PNS patients and 40 serum samples from healthy physical examination people to detect metabolites. The orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) was employed to study the metabolomics differences between control group and PNS patients group. A disease-specific metabolic diagnosis model was established, and metabolic pathway analysis was performed by using MetPA database. ResultsA OPLS-DA model (R2X=71.4%, Q2Y=0.517) was constructed with satisfactory discriminating ability to separate PNS patients and control groups. There were 9 disturbed pathways involved in PNS patients, of which thiamine metabolism, pyrimidine metabolism, phenylalanine metabolism and citric acid cycle metabolic pathways' influence values were greater than 0.1. ConclusionsThere are metabolic disorders of phenylalanine metabolism, thiamine metabolism, citric acid cycle metabolism and pyrimidine metabolism, which may be closely related to the occurrence and development of PNS.

metabolomics; liquid chromatography mass spectrometry; primary nephrotic syndrome; metabolic pathway; pathway analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102684)。

李鞠(1984-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樵l(fā)性腎病綜合征蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)。E-mail： liju198461@163.com

簡(jiǎn)介：唐鳳英(1977-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樵l(fā)性腎病綜合征蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)。E-mail： tangfengying_1976@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.30.001

R692.3；R363.2

A

1002-266X(2016)30-0001-04

2016-03-15)