劉青青，孫丹丹，馮　巍，陳　炯

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·法醫(yī)學(xué)·

常備試劑法提取人外周血DNA

劉青青1，孫丹丹2，馮巍3，陳炯3

目的探討使用一種常備試劑提取外周血DNA，而無需PK、毒性有機(jī)溶劑或特殊緩沖液。方法分別使用常備試劑法、試劑型kit法和柱式型kit法提取外周血DNA，進(jìn)而比較3種方法的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量。結(jié)果使用常備試劑法，提取200 μL人外周血的DNA量為(5.77±3.49) μg，低于試劑型kit法(P<0.05)，但與柱式型kit法(P=0.10)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常備試劑法提取的DNA樣品，A230/A260為0.49±0.05，A260/A280為1.98±0.10，片段大于15 kb，AluI、BamHI-HF酶切完全，PCR擴(kuò)增穩(wěn)定、高效，DNA質(zhì)量與兩種kit法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常備試劑法的每樣品耗費(fèi)低，操作時(shí)間約30～40 min。結(jié)論常備試劑法能夠保證外周血DNA產(chǎn)量和質(zhì)量，試劑方便易得，操作快速、安全，且費(fèi)用低廉，可作為一般實(shí)驗(yàn)室備選方案。

外周血；基因組DNA；DNA提取

從基礎(chǔ)生物研究到臨床診療，外周血是最常用的生物樣品之一[1-3]。DNA提取試劑盒通常價(jià)格昂貴，且不宜于長期存儲、隨時(shí)取用，因而在一般實(shí)驗(yàn)室，尤其是處理小批量外周血樣品時(shí)，手工提取方案仍然具有廉價(jià)、易于調(diào)控、無需特殊設(shè)備等優(yōu)勢[2,4-6]。但是，使用傳統(tǒng)手工方案提取外周血DNA，或者需要長時(shí)間酶解組織[7-8]，或者需要毒性有機(jī)試劑[4,8]，或者DNA質(zhì)量欠佳[9]，而且通常需要配制特殊的反應(yīng)緩沖液[2,5,8]。本研究擬使用一般實(shí)驗(yàn)室常備試劑，棄用蛋白酶、毒性試劑及特殊緩沖液，嘗試尋求一種簡便、安全、低廉且高效的外周血DNA提取方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料15% EDTA·2Na抗凝外周血20份，4 ℃冷藏時(shí)間小于32 h，由河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。

1.2DNA提取

1.2.1柱式型kit法取抗凝血200 μL，使用PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)，參照說明書提取DNA。

1.2.2試劑型kit法取抗凝血200 μL，使用DNAzol BD Reagent Kit(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)，參照說明書提取DNA。

1.2.3常備試劑法①取抗凝血200 μL加入1.5 mL離心管，加入3倍體積(600 μL)去離子水，輕彈離心管壁混勻；常溫4 000 g離心3 min；棄上清及影細(xì)胞。②加入2倍體積(400 μL)60 mol·L-1NaCl溶液，懸浮并分散沉淀物；常溫4 000 g離心3 min；棄上清及影細(xì)胞。此步驟可重復(fù)操作1～2次，至沉淀物呈灰白色。③加入2倍體積1×TE緩沖液(400 μL)，輕彈離心管壁，懸浮并分散沉淀物；再加入10% SDS 8 μL，顛倒混勻；65 ℃水浴5 min。④加入1倍體積6 mol·L-1NaCl溶液(200 μL)，渦流震蕩3～5 s；使用預(yù)冷離心機(jī)，離心力20 000 g，4 ℃離心5 min。⑤取上清500 μL，加入1 mL無水乙醇，混勻，4 ℃靜置5 min；使用預(yù)冷離心機(jī)，離心力20 000 g，4 ℃離心10 min。⑥棄上清，加入預(yù)冷70%乙醇400 μL，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次；使用預(yù)冷離心機(jī)，離心力20 000 g，4 ℃離心3 min。⑦棄上清，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干3 min，加入100 μL TE充分溶解DNA沉淀。

1.3DNA產(chǎn)量和質(zhì)量檢測

1.3.1紫外分光光度檢測使用FLA6000型紫外可見分光光度儀(杭州晶飛科技有限公司，中國)，測定DNA樣品的A230、A260、A280。

1.3.2瓊脂糖凝膠電泳取0.3～0.6 μg DNA樣品，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，0.5% EB染色成像。

1.3.3RE酶切取0.3～0.6 μg DNA，加入10 U BamHI-HF和2 μL 10×NEBuffer(NEB，USA)，用去離子水補(bǔ)足至20 μL；37 ℃溫育90 min。取0.3～0.5 μg DNA，加入5 U AluI和2 μL 10×NEBuffer 4(NEB，USA)，用去離子水補(bǔ)足至20 μL；37 ℃溫育30 min。酶切產(chǎn)物使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。

1.3.4PCR擴(kuò)增上下游PCR引物：849-F (5’-TTGTAACTCCTTTAAATTGATCAC-3’)和849-R (5’-CCATAACAAAATCTTTAATGGAA-3’) ，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。10 μL 反應(yīng)體系，包括0.1 μg DNA樣品，0.2 μM 849-F/R，200 μM dNTPs，0.5 U of Recombinant Taq DNA Polymerase (Takara Biotechnology Co.Ltd)和1×PCR buffer。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：98 ℃預(yù)變性30 s，而后98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s ，共計(jì)28個(gè)循環(huán)反應(yīng)，此后 72 ℃溫育5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。

2　結(jié)果

2.1DNA產(chǎn)量初始樣品量為200 μL人外周血，CRP的DNA產(chǎn)量為(5.77±3.49) μg，低于PureLink Genomic DNA Mini Kit[(8.79±4.39) μg，P<0.05]，但與DNAzol BD Reagent Kit差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [(6.46±3.64 ) μg，P=0.10]，見表1。

表1　3種方法提取200μL外周血DNA 的產(chǎn)量與純度比較

注：①與柱式型kit法比較:P<0.05。

2.2DNA質(zhì)量CRP提取DNA，其A230/A260為0.49±0.05，A260/A280為1.98±0.10，與kit法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。3種方法提取人外周血DNA，均富集于15～20 kb之間形成高亮條帶區(qū)，見圖1A。限制性內(nèi)切酶BamHI-HF、AluI消化完全，見圖1B、C。PCR擴(kuò)增均可獲得穩(wěn)定、清晰的產(chǎn)物譜帶，見圖2。

DNAzol BD Reagent Kit (第1、4、5道)，PureLink Genomic DNA Mini Kit (第2、6、7道)，常備試劑法(第3、8、9道)。DNA上樣量：第1～3道為0.6 μg，第4～9道為0.3 μg。M為DL15,000 DNA Marker圖1　A:瓊脂糖凝膠電泳;B:AluI酶消化處理；C:CBamHI-HF酶消化處理

DNAzol BD Reagent Kit(第1～3道)，PureLink Genomic DNA Mini Kit(第4～6道)，常備試劑法(第7～9道)。M為DL2,000 DNA Marker圖3　3種方法提取DNA樣品的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3試劑易得性、操作時(shí)間、安全性和費(fèi)用比較本文常備試劑法提取外周血DNA，僅需一次管間樣品轉(zhuǎn)移，能夠有效避免樣品交叉污染。同時(shí)，操作簡潔、快速，約30～40 min即可完成全血DNA提取，長于柱式kit法，但與試劑型kit法大致相同，見表2。

表2　3種DNA提取方法的毒性、操作時(shí)間和費(fèi)用比較

注：①產(chǎn)品手冊說明標(biāo)注。

3　討論

3.1DNA產(chǎn)量與質(zhì)量

DNA產(chǎn)量通常是評價(jià)DNA提取方法優(yōu)劣的首要指標(biāo)。使用本文常備試劑法，200 μL全血的DNA產(chǎn)量為(5.77±3.49) μg，最高可達(dá)12.76 μg，雖低于柱式kit法，但與試劑型kit法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用紫外分光光度法測評DNA純度，如果A230/A260/A280為1/1.8/1，則認(rèn)為DNA樣品中小分子、鹽類及蛋白質(zhì)殘留較少，純度較好[10-11]。本研究中常備試劑法提取外周血DNA，其A230/A260為0.49±0.05，A260/A280為1.98±0.10，雖略高于kit法，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DNA完整性是衡量DNA質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，涉及DNA一級結(jié)構(gòu)損傷問題(分子斷裂、堿基損傷或脫失、共價(jià)交聯(lián)等)，往往直接決定后續(xù)DNA分析工作的成敗。瓊脂糖凝膠電泳表明，3種方法提取的基因組DNA，均未見明顯涂抹樣降解的DNA碎片表現(xiàn)，且富集于15～20 kb之間形成高亮條帶區(qū)，因此，就DNA斷裂程度而言，本研究常備試劑法提取的DNA樣品，能夠滿足大多數(shù)DNA分析工作。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)選擇新鮮抗凝血或組織樣品，分別使用多種DNA提取方法時(shí)，凡是在細(xì)胞裂解后進(jìn)行短暫渦流震蕩操作，所得DNA樣品片段大小基本一致。對于3種方法提取的DNA樣品，均分別使用BamHI-HF、AluI處理，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示消化完全；分別進(jìn)行PCR常規(guī)擴(kuò)增，各DNA樣品均可獲得穩(wěn)定、清晰的產(chǎn)物譜帶；因此，就DNA完整性而言，3種方法之間無明顯差異。

3.2試劑易得性、操作時(shí)間、安全性和費(fèi)用

理想的DNA提取方法，除保證DNA產(chǎn)量和質(zhì)量之外，還要考慮設(shè)備和試劑易得性、操作快捷性和安全性、費(fèi)用等指標(biāo)。本研究中常備試劑法僅涉及去離子水、NaCl、SDS、1×TE緩沖液和乙醇，均是理化性質(zhì)穩(wěn)定的一般實(shí)驗(yàn)室常備試劑，僅需離心機(jī)、水浴箱和渦流振蕩器，因而適用范圍廣。而且不使用苯酚、氯仿、甲酰胺、鹽酸胍等任何毒性試劑，操作安全，也不會造成環(huán)境或人身損害[5,8]。本研究方法的操作時(shí)間大體與chelex法相近，而遠(yuǎn)小于蛋白酶K/苯酚法、經(jīng)典鹽析法乃至一些試劑盒提取法[2,4,8]。耗費(fèi)低廉是此常備試劑法的突出優(yōu)點(diǎn)，每樣品費(fèi)用不足0.05元，而柱式kit法、試劑型kit法則分別花費(fèi)28.42元、13.77元，因此費(fèi)用最為低廉[2,4]。

本研究的常備試劑法提取血樣DNA，不需配置特殊緩沖液，不使用毒性有機(jī)試劑，直接使用理化性質(zhì)穩(wěn)定的一般實(shí)驗(yàn)室常備試劑，操作安全性好，而且省時(shí)省力。獲取的DNA質(zhì)量不遜于柱式kit法和試劑型kit法。尤其突出的是本方法費(fèi)用低廉，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于兩種kit法，可作為一般實(shí)驗(yàn)室備選方案。

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A Common Reagents Protocol for DNA Extraction from Human Peripheral Blood Samples

LIU Qing-qing1,SUN Dan-dan2,FENG Wei3,CHEN Jiong3

(1.Xiayi People’s Procuratorate,Xiayi 476400,China;2.Luoyang Municipal Public Security Bureau,Luoyang 471000,China;3.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo propose a common reagents protocol (CRP) for DNA extraction from human peripheral blood samples.This CRP does not contain enzymes like proteinase-K,hazardous solvents like phenol,and special buffers like chaotropic agents.MethodsHuman peripheral blood samples were treated with the CRP,DNAzol BD Reagent Kit and PureLink Genomic DNA Mini Kit,respectively.Then the yield and quality of DNA extracted were evaluated and compared.ResultsThe average yield of DNA isolated by CRP was (5.77±3.49)μg that was lower than chaPureLink Genomic DNA Mini Kit (P<0.05),but the same as DNAzol BD Reagent Kit (P=0.10).The A230/A260 was 0.49±0.05,and A260/A280 was 1.98±0.10.Gel electrophoresis of the isolated DNA samples showed that the DNA fragments were above 15 kb.The isolated DNA was successfully digested by BamHI-HF or AluI restriction enzymes,and PCR amplification was also performed completely,indicating the DNA produced by CRP had acceptable quality.The CRP could be completed within 30～40 min.Furthermore,all the reagents were common and the most cost-effective of all methods.ConclusionThe efficiency,speed,safety,and cost-effectiveness make this CRP as an appropriate alternative to existing protocols for extracting DNA from peripheral blood in conventional laboratories.

peripheral blood；human genomic DNA；DNA extraction

1672-688X(2016)03-0219-04DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.017

國家自然科學(xué)基金(81501634)

2016-07-25

1.夏邑縣人民檢察院，河南夏邑476400

2.洛陽市公安局，河南洛陽 471000

3.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

劉青青(1986-)，女，河南夏邑人，法醫(yī)師，從事法醫(yī)學(xué)研究及鑒定工作。

Q785

A