聶愛婷，馬　波，歐俊興，胡利平，饒　旼，聶勝潔

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·基礎(chǔ)醫(yī)學·

人胚肺二倍體細胞衰老程度評價生物學指標研究

聶愛婷1，馬波2，歐俊興3，胡利平1，饒旼1，聶勝潔1

目的通過細胞生長曲線、流式細胞術(shù)檢測人胚肺二倍體細胞不同代次情況，篩選評價人胚肺二倍體細胞衰老程度的生物學指標。方法將Walvax-2細胞分為16個代次，繪制生長曲線，觀察不同代次Walvax-2細胞的生長增殖情況及細胞活力；通過核酸熒光染料碘化丙啶(PI)作為細胞活力分析的熒光探針使用流式細胞儀檢測不同代次Walvax-2細胞周期時相和細胞凋亡情況。結(jié)果P20和P30的細胞活力明顯強于P40和P50(均P<0.05)，P40的細胞活力明顯強于P50(P<0.05)；G0/G1期所占百分比與細胞代齡間的增長無相關(guān)性(P>0.05)，而S期、G2/M期和細胞碎片所占百分比與細胞代齡間的增長顯著相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論通過繪制生長曲線可區(qū)分相隔較大代次的Walvax-2細胞的生長活力，在進行細胞衰老綜合評定時，可通過PI作為熒光探針使用流式細胞儀檢測細胞周期變化作為Walvax-2細胞的衰老程度綜合評定的指標。

細胞衰老；細胞周期；細胞生長曲線；衰老評價

細胞衰老(cellular senescence)是指細胞在執(zhí)行生命活動過程中，隨著時間的推移，細胞增殖與分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程[1]。近幾年細胞衰老的研究大多集中在細胞周期機制、衰老的端粒學說、DNA損傷與衰老的關(guān)系、衰老相關(guān)基因和長壽基因等方面，但單一的細胞衰老指標只能反映細胞衰老過程中的某個環(huán)節(jié)情況。為全面深刻反映細胞衰老過程，本實驗以Walvax-2細胞為研究對象，分別在16個代次中篩選衰老程度評定指標，便于對細胞衰老程度進行評級和人胚肺二倍體成纖維細胞的生產(chǎn)應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

Walvax-2人胚肺二倍體細胞株(沃森生物科技技術(shù)有限公司)總壽命共58次分裂，PBS(云南沃森公司)，胰酶(云南沃森公司)，核糖核酸酶A(美國MBI)，碘化丙啶(propidium iodide，PI；上海碧云天生物試劑公司)，流式細胞儀(美國BECKMAN)。Walvax-2細胞經(jīng)無菌檢查、細胞內(nèi)、外源病毒因子檢查、支原體檢查、電鏡檢查等反復檢定證明其生物學性狀達到了制備病毒性疫苗細胞株的國際標準。

1.1細胞生長曲線繪制沃森公司在進行細胞建庫時發(fā)現(xiàn)Walvax-2細胞50代以前的細胞在傳代后，細胞很快就貼附于瓶壁，貼壁后的細胞開始為圓形，邊緣清晰且偏暗，隨著時間的推移，細胞逐漸變透明且開始伸展成梭狀的成纖維細胞，24 h內(nèi)分裂增殖成火焰狀排列，在顯微鏡下觀察到許多高度極性排列的區(qū)域，成漩渦狀，此時細胞完全變?yōu)槌衫w維二倍體細胞特有的形態(tài)特征，細胞飽滿，折光性好。在48 h后細胞成致密單層，細胞緊密接觸細胞變細拉長，在漩渦區(qū)域可以看到細胞呈多層交叉排列，取生長狀態(tài)良好的細胞 P20、P30、P40、P50共4個代次細胞按1∶3傳代，置于37 ℃培養(yǎng)3 d； P20、P30、P40、P50單層細胞消化后用40 mL生長液懸浮，取1 mL計數(shù)并計算出懸浮成50 000 cell/mL乘以500 mL所需要的懸浮液X(所需細胞懸液的量X=50 000 cells/mL×500 mL/計數(shù)濃度)，懸浮完成后分別種到30個T25(細胞培養(yǎng)瓶)，10 mL/T25，37℃培養(yǎng)，每隔24 h取3個T25計數(shù)，前3 d消化后取3 mL PBS一次懸浮3個T25，使3個T25中的細胞全部懸浮在3 mL PBS中，計數(shù)兩次，3 d后每個T25單獨懸浮，單獨計數(shù)，計數(shù)兩次，第4天對余下的T25更換培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)至第十天。

1.2流式細胞儀檢測取不同代次的Walvax-2細胞，倒去培養(yǎng)液，用胰酶消化收集細胞，用培養(yǎng)液吹打混勻，800 r·min-1離心15 min后棄上清，PBS洗兩遍，加0.5 mL PBS吹勻，務(wù)必吹散，用5 mL注射器將細胞吸起，迅速打入5 mL 70%(預冷)乙醇中，封口膜封口，4 ℃固定過夜。取固定細胞，800 r·min-1離心15 min 后收集細胞，PBS洗滌洗兩遍，0.5 mL PBS重懸細胞并轉(zhuǎn)至新離心管中輕輕吹打后，加入核糖核酸酶A約3 μL和PI約25 μL至終濃度50 μg·mL-1，37 ℃溫浴30 min后取出細胞，用300目(孔徑40～50 μm)尼龍網(wǎng)過濾，用流式細胞儀測定周期。

1.3統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，將流式細胞儀檢測結(jié)果與細胞代次之間進行相關(guān)雙變量的Pearson檢驗，將細胞生長曲線結(jié)果做配對秩和檢驗。

2　結(jié)果

2.1細胞生長行為的改變根據(jù)結(jié)果(圖1)：P20，P30第二至六天為對數(shù)期，第六天開始進入平臺期；P40、P50第二至七天為對數(shù)期，7 d后進入平臺期。4個代次的細胞增殖能力隨代齡增加而下降，差異具有統(tǒng)計學意義，見表1。

圖1　Walvax-2細胞20代、30代、40代和50代生長曲線

GroupDAIP20P40115.37±88.27P30P4097.52±59.58P40P5096.29±65.04P50P3081.16±58.66

2.2流式細胞儀檢測結(jié)果

2.2.1Walvax-2細胞周期變化Walvax-2細胞的細胞周期分為G0/G1期、S期和G2/M期。Walvax-2細胞的流式細胞儀結(jié)果分析：Walvax-2細胞的G0/G1期細胞量有少許波動，變化不大，見圖2。G2/M期細胞出現(xiàn)波動，S期細胞下降穩(wěn)定，P55發(fā)生細胞周期阻滯，S期細胞基本消失，見圖3。

圖2　25代Walvax-2細胞周期變化圖

圖3　5代Walvax-2細胞周期變化圖

2.2.2Walvax-2細胞碎片變化P20～P55的細胞碎片從5.38%達到36.83%，見表2。G2/M期同S期細胞量隨細胞代齡增長進程而降低，檢測到的細胞碎片隨細胞代齡增長增加。對比G2期和S期細胞數(shù)并進行比較，隨細胞代齡的增長，G2期和S期所占比例減少，說明衰老Walvax-2細胞發(fā)生G1期阻滯，見圖4。

表2　細胞周期細胞碎片流式細胞儀檢測結(jié)果　%

C:細胞碎片圖4　Walvax-2細胞周期構(gòu)成檢測結(jié)果分析

2.2.3細胞周期與細胞代齡的相關(guān)性在不同代次Walvax-2細胞中，隨著細胞代次的增加，細胞各周期與細胞代齡間的增長相關(guān)性結(jié)果(見表3)。即隨著細胞代次的增加，不同代次Walvax-2細胞的G0/G1期所占百分比與細胞代齡間的增長無相關(guān)性(P>0.05)，不同代次Walvax-2細胞的細胞碎片、S期和G2/M期所占百分比與細胞代齡間的增長顯著相關(guān)(P<0.05)。

表3　細胞周期相關(guān)雙變量分析

注：N為檢測細胞代次數(shù)量。

3　討論

體外培養(yǎng)的人類細胞在分裂一定的次數(shù)之后就會停止增殖，稱為細胞衰老。實際上在體外培養(yǎng)時不僅衰老的細胞逐漸增加，即使在年輕的細胞群體中也占有一定比例[2]，隨著分裂次數(shù)增多，細胞經(jīng)過一系列的表型和基因表達改變，衰老細胞在整個細胞群體的生命周期中的百分比逐漸增大，直到所有的細胞均進入老化狀態(tài)。其中，二倍體細胞與其他傳代細胞相比，理論上不存在致腫瘤的潛在危險性[3-4]。其作為培養(yǎng)病毒疫苗時所需要的主要原材料，其質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量[5-6]。而細胞本身的特性也是疫苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的重點。我國已上市的疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、風疹減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗分別使用了2BS、KMB-17、MRC-5細胞[7-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，衰老細胞的細胞代謝能力降低，會出現(xiàn)脂類、蛋白質(zhì)和DNA等細胞成分損傷。在細胞生長過程中穩(wěn)定生長停止、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性(senescence-associated β-galactosidase)、BMI-1基因、端粒酶RNA和p16(INK4A)的異質(zhì)性誘導等標志物與細胞衰老密切相關(guān)[10-12]。目前，系統(tǒng)性評價細胞衰老程度的研究尚未取得進展[2,10-14]。本研究以通過檢測不同代次人胚肺二倍體細胞生長曲線、細胞傳代周期中細胞構(gòu)成與細胞碎片變化情況等指標值，篩選評價人胚肺二倍體細胞衰老程度的生物學指標。

細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一[15]。但這種方法對同一樣品要求計數(shù)后取平均值，不但操作繁瑣和費時，而且誤差較大，可達到20%～30%[16]。由于Walvax-2細胞具備自身穩(wěn)定生長的特性，因而適合選用細胞生長曲線觀察細胞的生長變化。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)alvax-2細胞增殖能力隨代齡增加而下降，符合了細胞衰老程度與細胞增殖能力的關(guān)系，指標符合評價細胞衰老程度的需求。

流式細胞儀將流體噴射技術(shù)、激光光學技術(shù)、電子技術(shù)和計算機技術(shù)等集于一體，既可定性又可定量，具有簡單、快速和敏感性高的特點，可進行多參數(shù)和活體細胞分析[17]。在細胞周期的分裂過程中可分為：M/G1、S、G2/M 3個時期。核酸熒光染料碘化丙啶[18]是一種常用的細胞核熒光染料，作為一種溴化乙錠的類似物，PI可選擇性定量嵌入核酸雙螺旋堿基對之間，在激光激發(fā)下，能夠嵌入堿基對之間實現(xiàn)與雙鏈DNA結(jié)合，雖然PI不能穿透細胞膜而被排斥在活細胞外，但是可以穿過破損的細胞膜而對細胞核染色[19]，因此PI可作為細胞活力分析的熒光探針之一。本研究檢測了Walvax-2細胞不同代次細胞周期3個時期中的細胞百分比，Walvax-2細胞的G2/M期、S期和細胞碎片均可以作為評價細胞衰老程度的指標。

綜上所述，在體外培養(yǎng)人胚肺二倍體成纖維細胞時，可通過繪制生長曲線可區(qū)分相隔較大代次的Walvax-2細胞的生長活力，在進行細胞衰老綜合評定時，可通過流式細胞儀檢測細胞周期的變化，作為Walvax-2細胞的衰老程度綜合評定的指標。

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Study of Biological Indicators of Cellular Senescence Degree of Human Embryo Lung Diploid Cells

NIE Ai-ting1,MA Bo2,OU Jun-xing3,HU Li-ping1,RAO Min1,NIE Sheng-jie1

(1.School of Forensic Medicine,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.Yunnan Walvax Biotechnology Corporation Limited,Kunming 650106,China;3.Public Security Department of Yunnan Province,Kunming 650021,China)

ObjectiveTo detect the cell growth state and evaluate the biological indicators of senescence degree of human embryo lung diploid cells by growth curve and flow cytometry assay.MethodsThe Walvax-2 cells were splited into 16 generations to detect the cell proliferative ability and cell vitality in different generations of Walvax-2 cells by drawing growth curve.The cell cycle phase and cell apoptosis were analyzed by fluorescence activating cell sorter (FACS) assay on different generations Walvax-2 cells with propidium iodide(PI).ResultsThe cell vitality of P20and P30were stronger than the P40and P50(all P<0.05),and that of P40was stronger than the P50(P>0.05).The cell percentage of G0/G1phase has no association with the generations of Walvax-2 cells (P>0.05),however the synthesis phase,G2/M phase and cellular debris were significantly associated with the generations of Walvax-2 cells growth (all P<0.05).ConclusionDrawing growth curve can distinguish cell vitality of Walvax-2 cells which were separated by large generations.The cell cycle changes are detected by fluorescence activating cell sorter assay with propidium iodide and it can act as a biological indicator to evaluate the senescence degree of Walvax-2 cells.

cellular senescence;cell cycle; cell growth curve; senescence evaluation

1672-688X(2016)03-0161-04DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.001

國家科技部863計劃(2014AA021002)

2016-05-08

1.昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院，云南昆明 650500

2.云南沃森生物技術(shù)股份有限公司，云南昆明 650106

3.云南省公安廳，云南昆明 650021

聶愛婷(1989-)，女，山東東營人，從事法醫(yī)物證學研究工作。

Q255

A