劉睿洋劉 芳張振乾 官春云

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家油料改良中心湖南分中心， 湖南長沙 410128

甘藍(lán)型油菜BnFAD2-C5基因啟動(dòng)子及內(nèi)含子在表達(dá)水平的功能分析

劉睿洋**劉 芳**張振乾 官春云*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家油料改良中心湖南分中心， 湖南長沙 410128

富含油酸的菜籽油具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 使得高油酸育種及油酸形成機(jī)制成為熱點(diǎn)。油酸脫氫酶基因（FAD2基因）是控制油酸含量的關(guān)鍵酶基因。本文針對(duì)BnFAD2-C5基因展開研究， 根據(jù)油菜和甘藍(lán)的同源性， 克隆了1257 bp啟動(dòng)子序列， 利用 GUS和 GFP作為報(bào)告基因分別構(gòu)建含有不同片段長度的啟動(dòng)子和內(nèi)含子的缺失載體并轉(zhuǎn)化擬南芥， 經(jīng)GUS染色檢測發(fā)現(xiàn)-319 ～-1 bp為該研究中最小啟動(dòng)子； 采用Western blot技術(shù)分析啟動(dòng)子和內(nèi)含子不同區(qū)域的功能， 發(fā)現(xiàn)BnFAD2-C5啟動(dòng)子區(qū)域-1257 ～-1020 bp和-319 ～-1 bp能夠誘導(dǎo)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)育中期高效表達(dá)， BnFAD2-C5內(nèi)含子具有增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的功能， 該功能主要由+631～ +1033 bp區(qū)域調(diào)控。

甘藍(lán)型油菜； BnFAD2-C5基因； 內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)； 擬南芥

菜籽油在我國食用成品油市場占有重要地位，高油酸菜籽油不容易被氧化， 保鮮更持久［1-3］， 具有重要的商業(yè)價(jià)值［4］。因此， 油酸含量的高低也成為評(píng)判油菜品質(zhì)的重要指標(biāo)， 同時(shí)， 高油酸育種及形成相關(guān)機(jī)理也成為目前各油料作物研究的熱點(diǎn)［5-6］。

目前在高油酸育種方面， 通過傳統(tǒng)育種的手段，官春云等［7］用60Co輻射誘變獲得油酸含量高達(dá)93.5%的材料， 和江明等［8］利用 EMS誘變油菜小孢子獲得油酸含量為80.34%的材料。油酸脫氫酶基因（fatty acid desaturase， FAD2）作為控制油酸、亞油酸和亞麻酸含量的主要基因［9-10］， 其功能主要是將油酸磷脂膽堿去飽和成亞油酸磷脂膽堿。Stoutjesdijk等［10］通過共抑制法沉默甘藍(lán)型油菜 FAD2基因， 將油酸含量提高至89%； Peng等［11］通過RNAi技術(shù)將甘藍(lán)型油菜FAD2基因和FAE1基因共同沉默， 使油酸含量提高至85.34%。然而， 與高油酸油菜育種相比， 油酸形成機(jī)制的研究則比較落后。詳細(xì)探究脂肪酸代謝路徑中的關(guān)鍵酶基因（FAD2基因）的調(diào)控機(jī)制， 將有助于充分利用 FAD2基因?yàn)楦哂退嵊N提供參考。2006年， Kim等［12］通過缺失分析的手段，對(duì)芝麻FAD2基因（SeFAD2）上游調(diào)控序列分析研究，發(fā)現(xiàn)在上游5′端非翻譯區(qū)（untranslated region， UTR）內(nèi)部存在一個(gè)1131 bp長度的內(nèi)含子， 并且具有增強(qiáng)啟動(dòng)子功能的效應(yīng)， 而啟動(dòng)子區(qū)域則主要含有一些起到負(fù)調(diào)控作用的順式作用元件。同時(shí)證實(shí)脫落酸（abscisic acid， ABA）可以促進(jìn)芝麻FAD2啟動(dòng)子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功能， 增強(qiáng)SeFAD2基因的表達(dá)， 并確定了ABA應(yīng)答元件在啟動(dòng)子上的大致區(qū)域。Xiao等［13］通過對(duì)甘藍(lán)型油菜 BnFAD2-A5基因研究， 預(yù)測并分析了該啟動(dòng)子及內(nèi)含子上的順式作用元件，通過檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中 GUS活力， 證明BnFAD2-A5啟動(dòng)子屬于組成型啟動(dòng)子， 其內(nèi)含子同樣具有增強(qiáng)基因表達(dá)的功能。BnFAD2-A5啟動(dòng)子的活性受 ABA的誘導(dǎo)出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象， 并且定位到ABA在啟動(dòng)子上的順式作用結(jié)合位點(diǎn) ABRE所處的位置。

本實(shí)驗(yàn)室前期已克隆到甘藍(lán)型油菜 BnFAD2基因的4個(gè)拷貝（BnFAD2-A5、BnFAD2-C5、BnFAD2-A1 和BnFAD2-C1）， 初步分析了BnFAD2-A5［13］和BnFAD2-C1［14］在轉(zhuǎn)錄水平的功能， 而BnFAD2-A1則是假基因（待發(fā)表）， 因此本研究針對(duì) BnFAD2-C5基因展開研究， 克隆 BnFAD2-C5啟動(dòng)子， 采用生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子及內(nèi)含子的順式作用元件， 通過PCR技術(shù)構(gòu)建啟動(dòng)子及內(nèi)含子的缺失載體并轉(zhuǎn)化擬南芥， 分析BnFAD2-C5啟動(dòng)子和內(nèi)含子的功能， 旨在為高油酸油菜分子育種在表達(dá)水平提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜湘油15和擬南芥（Arabidopsis thaliana Col）由國家油料改良中心湖南分中心提供。大腸桿菌 trans-T1購自北京全式金公司， pCAMBIA1303載體和農(nóng)桿菌 GV3101均由湖南省作物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳信波教授贈(zèng)予。

1.2 克隆BnFAD2-C5啟動(dòng)子區(qū)域

本實(shí)驗(yàn)室已通過RACE技術(shù)克隆了BnFAD2-C5基因的全長序列， 確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)， 且發(fā)現(xiàn)在5′UTR內(nèi)部含有一個(gè)內(nèi)含子序列（圖1）。在此基礎(chǔ)上， 本研究根據(jù)油菜與甘藍(lán)的同源性， 依據(jù)甘藍(lán)數(shù)據(jù)庫信息（http：//ocri-genomics.org/bolbase），在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約 1700 bp處設(shè)計(jì)正向引物PBn-F1 （5′-AAATGAAATGAAAATCATGGTAGGTG-3′）， 在該基因編碼區(qū)內(nèi)部設(shè)計(jì)反向引物CDS-R （5′-GCTTGATGTTGTGTCGGTTTCAGACTT-3′）， 通過PCR技術(shù)從甘藍(lán)型油菜基因組DNA中擴(kuò)增BnFAD2-C5啟動(dòng)子區(qū)域， 然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并測序。

圖1 BnFAD2-C5序列結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Model of BnFAD2-C5 gene structure

1.3 生物信息學(xué)分析

利用 PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/ PLACE）和PlantCARE （http：//www.intra.psb.ugent.be：8080/PlantCARE）網(wǎng)站對(duì) BnFAD2-C5啟動(dòng)子及內(nèi)含子序列預(yù)測分析。

1.4 啟動(dòng)子及內(nèi)含子缺失表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥的轉(zhuǎn)化

缺失載體構(gòu)建過程中所用引物見表1。采用PBn-F1和IBn-r引物從基因組中克隆啟動(dòng)子+內(nèi)含子片段， 經(jīng) Hind III/Nco I雙酶切處理， 連接到pCAMBIA1303載體， 構(gòu)建表達(dá)載體 Bn-1， 導(dǎo)入大腸桿菌保存。以含有Bn-1載體的大腸桿菌菌液為模板， 分別以引物 PBn-F1/PBn-R、PBn-F2/PBn-R、 PBn-F3/PBn-R、PBn-F4/PBn-R、PBn-F5/PBn-R克隆啟動(dòng)子缺失片段， 經(jīng) Hind III/Nco I雙酶切處理后，按照上述方法， 將其連接到 pCAMBIA1303載體，構(gòu)建啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體 BnP-1、BnP-2、BnP-3、BnP-4和BnP-5 （圖2）。

同樣以含有 Bn-1載體的大腸桿菌菌液為模板，以IBn-F/IBn-r引物進(jìn)行擴(kuò)增； 以IBn-R1、IBn-R2、IBn-R3和IBn-R4為反向引物， IBn-F1為正向引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增， 各取 3 μL PCR產(chǎn)物與 3 μL IBn-F/IBn-r產(chǎn)物進(jìn)行融合 PCR， 反應(yīng)體系含緩沖液4 μL、dNTPs 2 μL、HS Taq聚合酶0.5 μL、ddH2O 7.5 μL； 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min ； 95 ℃ 50 s， 58℃ 50 s，72 ℃ 4 min， 15個(gè)循環(huán)。取2 μL融合產(chǎn)物作為模板，以IBn-F1/IBn-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 5 min； 95 ℃ 50 s， 58℃ 50 s， 72 ℃ 4 min， 25個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。將融合產(chǎn)物克隆到大腸桿菌并測序。選擇測序正確的菌株搖菌， 提取質(zhì)粒并進(jìn)行Hind III/Nco I雙酶切， 然后將酶切后的產(chǎn)物純化并連 接 到經(jīng) Hind III/Nco I 雙酶 切 處理 的pCAMBIA1303載體， 構(gòu)建內(nèi)含子缺失載體BnI-1、BnI-2、BnI-3和BnI-4 （圖2）。以含有CaMV35S啟動(dòng)子的 pCAMBIA1303載體為陽性對(duì)照， 去除CaMV35S啟動(dòng)子的作為陰性對(duì)照。

表1 不同長度BnFAD2-C5啟動(dòng)子片段和引物序列Table1 Different fragments of the BnFAD2-C5 promoter and the primer sequences

圖2 缺失載體構(gòu)建模式圖Fig.2 Construction pattern diagram of deleted vector

將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101， 將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液涂到含有慶大霉素（GM）和卡那霉素（Kan）的YEB固體平板篩選， 挑選單菌落進(jìn)行PCR檢測， 并將陽性菌液保存于-80℃。在轉(zhuǎn)化擬南芥前， 將含有目的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌畫線接種于含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB固體平板， 28℃倒置培養(yǎng)2 d， 挑取單菌落于10 mL含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB液體培養(yǎng)基搖過夜， 取2 mL接種于50 mL含有50 mg L-1GM+50 mg L-1Kan的YEB液體培養(yǎng)基， 待其OD600為0.4～0.6時(shí)， 收集菌體（5000轉(zhuǎn) min-1， 5 min）， 用5 mL 10 mmol L-1MgSO4溶液重懸， 加入5 μL乙酰丁香酮（200 μmol L-1）于暗光下靜置 1.5 h。隨后加入100 mL滲透培養(yǎng)基， 通過花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.5 GUS染色及GFP蛋白相對(duì)表達(dá)量分析

參照 Jefferson等［15］GUS組織化學(xué)檢測的方法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥種子不同發(fā)育時(shí)期（4、7、10和13 d） GUS表達(dá)情況。以GFP為報(bào)告基因， 以Actin為內(nèi)參， 通過Western blot技術(shù)對(duì)GFP和Actin顯影，利用 Quality One軟件將 Western雜交斑點(diǎn)數(shù)字化，以GFP含量比Actin含量所得的數(shù)值表示GFP蛋白的相對(duì)含量， 以此確定不同缺失載體啟動(dòng)報(bào)告基因GFP的功能大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子區(qū)域的克隆及 BnFAD2-C5基因上游序列的生物信息學(xué)分析

根據(jù)油菜和甘藍(lán)的同源性， 同源克隆了1257 bp啟動(dòng)子序列， 與甘藍(lán)基因組序列僅有 2個(gè)堿基的差異。利用PLACE和PlantCARE網(wǎng)站對(duì)BnFAD2-C5基因啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域預(yù)測分析（圖3）， 發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域存在核心啟動(dòng)子必備的元件 TATA box （-139 bp）和CAAT box （-61 bp）， 同時(shí)還存在一些控制基因高效轉(zhuǎn)錄的元件（CCAATT box， GATA， 5′UTR Py-rich）， 激素應(yīng)答元件（TCA motif、CGTCA motif、ABRE、MYB、MYC和GARE）， 根毛特異性元件（root hair specific element， RHE）， 光調(diào)控元件（GAG，G-boxGT-1 consensus合Dof）， 花粉特異性表達(dá)元件（GTGA）， 胚乳特異性表達(dá)元件（ACGT）， 以及具有正、負(fù)調(diào)控功能的元件CACA。

在內(nèi)含子區(qū)域， 同樣存在 TATA box和 CAAT box， 分別位于+1241 bp和+1040 bp處。另外， 內(nèi)含子區(qū)域也包含一些順式作用元件， 如胚乳特異性表達(dá)原件（ACGT， Skn-1motif）， 激素應(yīng)答原件（MYB、MYC、GARE）， 分生組織特異性原件（CAT box）， 抗性原件（W-box）， 光控原件（G-box、GT-1consensus），熱激蛋白原件（heatshockprotein element， HSE）以及Dof和E-box。

2.2 BnFAD2-C5啟動(dòng)子功能分析

由GUS染色結(jié)果（圖4）可知， 當(dāng)BnFAD2-C5啟動(dòng)子缺失掉大部分區(qū)域， 僅保留-136 ～ +137 bp區(qū)域時(shí)（BnP-5）， GUS染色結(jié)果與陰性對(duì)照相同， 該部分序列不能發(fā)揮啟動(dòng)子功能， 而 BnP-1、BnP-2、BnP-3和BnP-4均有不同程度的著色。將含有BnP-1、BnP-2、BnP-3和BnP-4的轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)育中的種子進(jìn)行蛋白相對(duì)定量檢測， 將 Western blot結(jié)果經(jīng)Quality軟件數(shù)字化后， 以GFP含量比Actin含量所得的數(shù)值表示 GFP蛋白的相對(duì)含量， 結(jié)果如圖5。BnP-1和BnP-4的GFP蛋白相對(duì)含量高于BnP-2和BnP-3， 而BnP-2和BnP-3的相對(duì)蛋白含量較為接近，說明在缺失的-1257 ～-1020 bp區(qū)間存在調(diào)控基因高表達(dá)的正調(diào)控元件， 在-581 ～-319 bp區(qū)間存在抑制基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件， 且主要是抑制-319 ～-1 bp區(qū)間的順式作用元件的功能發(fā)揮。BnP-1和BnP-4在種子發(fā)育中期出現(xiàn)表達(dá)高峰， 而 BnP-2和 BnP-3在整個(gè)種子發(fā)育過程中表達(dá)量變化較為平緩， 說明在-1257～-1020 bp和-319～-1 bp區(qū)間存在某些調(diào)控元件誘導(dǎo)報(bào)告基因GFP在種子發(fā)育中期高效表達(dá)。

2.3 BnFAD2-C5內(nèi)含子功能分析

由圖5-A中BnP-1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子GFP蛋白相對(duì)含量與圖6-A中Bn-1比較可知， BnFAD2-C5內(nèi)含子具有增強(qiáng)啟動(dòng)子功能的效應(yīng)， 為了研究發(fā)揮這一增強(qiáng)效應(yīng)的內(nèi)含子區(qū)域， 本研究將內(nèi)含子區(qū)間缺失并轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證。分別采用GUS染色和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥不同發(fā)育時(shí)期（4、7、10 和13 d）種子中報(bào)告基因GUS/GFP的含量。GUS染色結(jié)果顯示， 隨著內(nèi)含子片段的逐步缺失， 染色有不同程度的變化（圖7）， 說明內(nèi)含子不同區(qū)域發(fā)揮著一定的功能。利用Quality One軟件將Western雜交斑點(diǎn)數(shù)字化后繪制曲線（圖6）， 發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺失+631～+1033 bp區(qū)域后， GFP蛋白相對(duì)含量大幅下降， 當(dāng)繼續(xù)缺失+526 ～ +631 bp時(shí)， GFP相對(duì)蛋白含量幾乎降至零， 但下降幅度減小， 說明在+631 ～ +1033 bp區(qū)域存在正調(diào)控元件促進(jìn)基因的高效表達(dá)， 在+526 ～+631 bp區(qū)域也存在正調(diào)控元件， 但功能較弱。隨著進(jìn)一步的缺失， BnI-3和BnI-4 GFP蛋白相對(duì)含量逐漸上升， 說明在缺失掉的+266 ～ +526 bp區(qū)間， 含有負(fù)調(diào)控元件抑制啟動(dòng)子的功能。因此， 推測內(nèi)含子的增強(qiáng)效應(yīng)主要取決于+631 ～ +1033 bp區(qū)域順式作用元件的功能發(fā)揮。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中BnFAD2-C5啟動(dòng)子的功能分析Fig.5 Functional analysis of BnFAD2-C5 promoter in transgenic Arabidopsis seed

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中BnFAD2-C5內(nèi)含子功能分析Fig.6 Functional analysis of BnFAD2-C5 intron in transgenic Arabidopsis seed

3 討論

圖7 含有BnFAD2-C5內(nèi)含子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子GUS染色結(jié)果Fig.7 Histochemical staining of GUS in transgenic Arabidopsis seed with BnFAD2-C5 intron

3.1 內(nèi)含子具有增強(qiáng)BnFAD2-C5表達(dá)水平的功能

BnFAD2-C5基因的全長序列已克隆， 發(fā)現(xiàn)長度為1123 bp的內(nèi)含子位于5′UTR內(nèi)部。類似的序列特征在玉米［16］、大豆［17］、擬南芥［12］、芝麻［12］和油菜［13］中均有報(bào)道， 且發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)含子通常具有增強(qiáng)效應(yīng)。本文也證實(shí)該內(nèi)含子具有增強(qiáng)BnFAD2-C5基因表達(dá)水平的功能。一般而言， 內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)由內(nèi)含子剪切模式［18］、內(nèi)含子的長度［19］以及內(nèi)含子的特殊元件決定， 但是Parra等［20］認(rèn)為內(nèi)含子剪切模式不足以對(duì)啟動(dòng)子功能產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)， Carola等［21］證實(shí)內(nèi)含子的長度越長其增強(qiáng)效應(yīng)越強(qiáng)。在本研究中， 缺失掉大部分內(nèi)含子序列的BnI-4其GFP蛋白相對(duì)含量卻比BnI-3和BnI-4有所增加， 那么， 認(rèn)為內(nèi)含子的長度并不是導(dǎo)致該內(nèi)含子發(fā)揮增強(qiáng)效應(yīng)的原因，該內(nèi)含子的增強(qiáng)效應(yīng)極有可能是特殊的調(diào)控元件與啟動(dòng)子區(qū)域互作引起的。當(dāng)內(nèi)含子+631～ +1033 bp區(qū)域缺失后， GFP蛋白相對(duì)含量明顯下降， 而隨著進(jìn)一步缺失并沒有再次引起GFP蛋白相對(duì)含量的大幅下降（圖5-A）， 說明內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)域主要存在于+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 而不是整個(gè)內(nèi)含子區(qū)間。Parra等［20］認(rèn)為， 內(nèi)含子的增強(qiáng)效應(yīng)元件主要存在于內(nèi)含子的5′端， 而不是內(nèi)含子的3′端， 在5′UTR和編碼區(qū)也會(huì)大量出現(xiàn)。如果內(nèi)含子含有大量 CGATT拷貝， 則會(huì)大幅增加基因的表達(dá)量。在油菜BnFAD2-C5內(nèi)含子的5′端+262 ～ +266 bp處存在一個(gè)CGATT，并且BnI-4 GFP蛋白相對(duì)含量高于BnI-1、BnI-2和BnI-3， 所以當(dāng)+266 ～ +631 bp區(qū)間的負(fù)調(diào)控元件被解除后， CGATT元件極有可能增強(qiáng)了基因的表達(dá)水平， 導(dǎo)致BnI-4中GFP蛋白相對(duì)含量增加。Kim等［12］發(fā)現(xiàn)芝麻 FAD2基因的內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)域?yàn)?791 ～+1517 bp， 處于遠(yuǎn)離內(nèi)含子5′端的位置， 并推測內(nèi)含子中具有增強(qiáng)功能的元件與增強(qiáng)子的作用方式相近，并不受距離的影響， 可以在遠(yuǎn)距離發(fā)揮增強(qiáng)作用。本研究中BnFAD2-C5內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)的主效元件位于+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 也遠(yuǎn)離內(nèi)含子 5′端， 推測該內(nèi)含子功能的發(fā)揮不受距離的影響， 發(fā)揮功能的元件可以遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。

Rose［22］研究發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)主要是富含U的序列導(dǎo)致， 內(nèi)含子的 5′和 3′剪切位點(diǎn)和分支點(diǎn)突變時(shí)， 會(huì)影響內(nèi)含子的剪切， 但不一定會(huì)引起內(nèi)含子增強(qiáng)效應(yīng)的減弱。我們分析了+631 ～ +1033 bp區(qū)域， 其中存在 38.7%的 U序列， 同時(shí)還存在ABRE/MYB/MYC、E-box、GARE元件， 研究發(fā)現(xiàn)這些元件在油菜種子napA啟動(dòng)子和擬南芥中， 當(dāng)植物受到干旱刺激和病原菌危害時(shí)能夠增強(qiáng)相應(yīng)啟動(dòng)子的功能， 誘導(dǎo)基因的高表達(dá)［23-24］。

3.2 BnFAD2-C5啟動(dòng)子具有誘導(dǎo)基因表達(dá)的功能

從圖4-C可知， 含有BnP-1和BnP-4的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)育至7 d時(shí)， 出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象， 具有典型誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)， BnP-2和BnP-3則呈現(xiàn)組成型表達(dá)的特點(diǎn)， 在種子發(fā)育的各個(gè)時(shí)期蛋白含量變化微弱。因此我們認(rèn)為-1020 ～-319區(qū)域存在控制基因組成型表達(dá)的相關(guān)元件。在BnP-1的-1257 ～-1020 bp和BnP-4的-319 ～-1 bp中存在某些元件在種子發(fā)育至7 d時(shí)可以被激活， 誘導(dǎo)該基因的表達(dá)， 通過PLACE和 PlantCARE網(wǎng)站預(yù)測可知， 在-1257～-1020 bp和-319～-1 bp分別含有 2 Dof， 3 GT-1consensus、BoxII、TCA motif、GAG和GATA、G-box、3GT-1consensus、4 Dof、GAG、GC-motif、CGTCA motif、TATA-box和CAAT-box。GT-1consensus在病原菌和NaCl的誘導(dǎo)下會(huì)促進(jìn)SCaM-4基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄［25］， TCA motif是水楊酸應(yīng)答元件， 抑制iMyAP基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄［26］。Dof、BoxII、GAG是光誘導(dǎo)調(diào)控元件， 感受光刺激誘導(dǎo)基因的表達(dá)， Dof蛋白結(jié)合Dof調(diào)控位點(diǎn)增強(qiáng)cyPPDK基因和PEPC基因的轉(zhuǎn)錄［27］。CGTCA motif是茉莉酸應(yīng)答元件，當(dāng)植物體內(nèi)茉莉酸含量上升時(shí)， 誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)［26，28］。GATA元件， 具有增強(qiáng)cab基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄水平的功能［29］。CAAT-box能提高轉(zhuǎn)錄起始頻率， 并且參與基因表達(dá)量的調(diào)控［30］。因此， 下一步工作可以針對(duì)-1257 ～-1020 bp和-319 ～-1 bp區(qū)域展開研究， 探索對(duì)BnFAD2-C5基因發(fā)揮誘導(dǎo)功能的主效區(qū)域及主效元件。

4 結(jié)論

克隆了 BnFAD2-C5啟動(dòng)子序列， 其-1257～-1020 bp和-319～-1 bp區(qū)域具有誘導(dǎo)基因表達(dá)的功能； BnFAD2-C5內(nèi)含子具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的效應(yīng)，這一功能主要由+631～ +1033 bp區(qū)域調(diào)控。

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Functional Analysis of BnFAD2-C5 Promoter and Intron at Expression Level in Brassica napus

LIU Rui-Yang**， LIU Fang**， ZHANG Zhen-Qian， and GUAN Chun-Yun*

College of Agriculture， Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan， Changsha 410128， China

High oleic rapeseed breeding and the formation mechanism of oleic acid have become a central issue after finding the important economic value of rapeseed oil with high oleic acid.The fatty acid dehydrogenase gene （FAD2） is a key enzyme gene to control oleic acid content， but the regulation of FAD2 gene is not well understood.According to the homology between rapeseed and oleracea， the BnFAD2-C5 promoter sequence of 1257 bp was cloned.Promoter and intron of BnFAD2-C5 gene were analyzed using β-glucuronidase （GUS） reporter and green fluorescent protein （GFP） reporter system to construct deleted vectors and transform Arabidopsis thaliana.Deletion analysis of BnFAD2-C5 promoter through GUS stainning revealed that-319 to-1 bp was the minimum promoter region.And deletion analysis of BnFAD2-C5 promoter and intron through GFP reporter system using western technique showed that-1257 to-1020 bp and-319 to-1 bp regions of BnFAD2-C5 promoter could induce expression of reporter genes effectively in transgenic Arabidopsis seed in the mid stage of seed development， while BnFAD2-C5 intron could confer the enhancement of promoter’s function and the intron-mediated enhancement region was mainly located in +631 to +1033 bp.

Brassica napus； BnFAD2-C5 gene； Intron-mediated enhancement； Arabidopsis thalina

10.3724/SP.J.1006.2016.01471

本研究由湖南省科技創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2013A012）和國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（2015CB150200）資助。

This study was supported by the Science and Technology Innovation Project of Hunan Province （CX2013A012） and the National Basic Research Program of China （2015CB150200）.

（Corresponding author）： 官春云， E-mail： guancy2011@aliyun.com

聯(lián)系方式： E-mail： ruiyang_liu2007@126.com**同等貢獻(xiàn)（Contributed equally to this work）

Received（）： 2016-02-16； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-06-06.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160606.0855.002.html