廢紙酶法糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究

用植物纖維原料這樣的可再生資源生產(chǎn)乙醇燃料，是最有希望替代傳統(tǒng)的石油燃料的方法之一。該文以舊報(bào)紙和辦公廢紙作為原料，用里氏木霉Rut C-30（纖維素突變異種）和黑曲霉F38混合培養(yǎng)生產(chǎn)纖維素分解酶，通過(guò)酶水解廢紙中纖維素組分制得乙醇。研究發(fā)現(xiàn)，表面活性劑預(yù)處理對(duì)廢紙酶消化率有影響，當(dāng)表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時(shí)，舊報(bào)紙的酶消化率提高約為45%。

目前，世界上大多以淀粉和糖漿為原料生產(chǎn)燃料乙醇并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看這受到規(guī)模限制和不可持續(xù)性；而以木質(zhì)纖維素為原料的第二代生物燃料乙醇是決定未來(lái)大規(guī)模替代石油的關(guān)鍵。無(wú)論從經(jīng)濟(jì)和環(huán)境角度看，用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇具有諸多優(yōu)勢(shì)。纖維素通常含50%～80%（按干基折算）的碳水化合物，主要是戊糖和己糖單元的聚合物。大多數(shù)碳水化合物可以通過(guò)化學(xué)或生物處理用于生產(chǎn)生物質(zhì)燃料，如乙醇。

利用工業(yè)纖維廢物作為生產(chǎn)乙醇的原料，可大幅降低生產(chǎn)成本。然而，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，預(yù)處理時(shí)需要破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使水解酶更容易與碳水化合物作用。目前預(yù)處理方法主要有爆破法、酸、堿、有機(jī)溶劑、堿性過(guò)氧化氫、氨水和高溫液態(tài)水處理等。預(yù)處理工藝的選擇直接影響到廢物原料的處理，即影響到纖維素的轉(zhuǎn)化率和水解酶的性能。目前，纖維素酶水解生產(chǎn)乙醇技術(shù)是可行的。預(yù)處理要選擇高產(chǎn)率、低副產(chǎn)物、低能耗、條件溫和、環(huán)境友好的處理工藝。纖維素可以被纖維素混合酶糖化發(fā)酵生成可溶性物質(zhì)，混合酶包括纖維素酶（內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）和半纖維素酶β（木聚糖酶）。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)攻擊纖維素分子鏈，將其分解成低聚糖，低聚糖分子鏈兩端經(jīng)外切葡聚糖酶降解為纖維二糖，再經(jīng)β-葡萄糖苷酶降解成葡萄糖單糖。另一方面，木聚糖酶水解木聚糖（半纖維素的主要成分）有利于去除木素，避免木素抑制纖維素酶的活性。由多種微生物作用于組成完整的纖維素酶系統(tǒng)，其中，絲狀真菌里氏木霉是纖維素降解微生物中的典型代表酶。這些纖維素酶是重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織和造紙行業(yè)等。

本研究采用里氏木霉RutC-30（纖維素突變異種）和黑曲霉F38混合培養(yǎng)生成纖維素分解酶，采用單獨(dú)糖化發(fā)酵（SHF）法測(cè)試了多種因素對(duì)廢紙生產(chǎn)乙醇的影響。

1 原料和方法

1.1 原料和微生物

廢紙，本地收集。

表面活性劑吐溫20、吐溫80、TritonX-100、p-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（p NPG）、3，5-二硝基水楊酸、羧甲基纖維素（CMC）和葡萄糖等。十二烷基磺酸鈉（SDS）和聚乙二醇（PEG 6000）。

檢測(cè)廢紙用的商品纖維素酶Novo 342、Danimax 89-2、Kamaistone K-050和Cellusoft。真菌里氏木霉Rut C-30，黑曲霉F38。

1.2 纖維素酶的生產(chǎn)

真菌里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38分別作為纖維素酶和β-葡萄糖苷酶（BGL）的接種物。作為生產(chǎn)纖維素酶和BGL的中性無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基組成如下（單位為g/L）：尿素為0.3，KH2PO4為2，（NH4）2SO4為1.4，MgSO4·7H2O為0.3，蛋白胨為0.75，酵母膏為0.25，CaCl2·2H2O為0.4，添加1mL/L微量元素溶液（MnSO4為1.6 g/L，ZnSO4為1.4 g/L，F(xiàn)eSO4為5 g/L和CoCl2為2 g/L）。初始pH為4.8，3%麥麩作為碳源生成酶菌。黑曲霉置于500mL錐形瓶，其中含120 mL培養(yǎng)質(zhì)，溫度控制在30℃，旋轉(zhuǎn)混合器（160 r/ min）培養(yǎng)5天。里氏木霉Rut C-30的培養(yǎng)是在容積為3.6 L攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行，其工作容積1.6 L。生物反應(yīng)器（碟形底玻璃夾套反應(yīng)釜）安裝有檢測(cè)和/或控制攪拌速度、溫度、pH和溶解氧濃度的儀表。培養(yǎng)溫度控制在30℃，溶解氧保持在20%以上，pH=5（通過(guò)自動(dòng)添加氨水和磷酸來(lái)調(diào)節(jié)和控制）。纖維素酶的培養(yǎng)是在溫度120℃下消毒滅菌20min，再發(fā)酵5天后，菌絲體在攪拌速度8 000 r/min下離心過(guò)濾10 min，取上層清液備用。

1.3 分析方法

纖維素酶活采用高斯法測(cè)定濾紙酶活，濾紙酶活的單位表示為FPU。這種方法是以檸檬酸鹽作緩沖液（0.05 mol/L，pH=4.8），在50 mg Whatman 1號(hào)濾紙上溫度50℃培養(yǎng)，測(cè)量60min后0.5mL酶溶液生成還原糖的量。內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶（或羧甲基纖維素酶）的測(cè)量是在溫度50℃條件下，0.05 mol/L檸檬酸鈉作緩沖液（pH=4.8），測(cè)量30 min后從0.5 mL酶溶液和0.5 mL 2% CMC混合溶液中生成還原糖的量。濾紙酶活和CMC酶活的測(cè)定是以不同的底物但以相同的原理來(lái)評(píng)價(jià)還原糖的量。還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定。

廢紙?jiān)跍囟?0℃下烘干至恒量，干燥器中冷卻并稱重。依據(jù)勃朗寧所描述的測(cè)定方法，絕干廢紙的纖維素、半纖維素和木素的定量測(cè)定采用硫酸水解法?；曳值臏y(cè)定是將干燥的廢紙放入馬弗爐灼燒，其溫度為500℃。乙醇和糖的含量測(cè)定采用高效液相色譜法配有折射率檢測(cè)儀（RID）和多孔性陰離子交換樹(shù)脂HPX-87H色譜柱。溫度控制在60℃，5mmol/L H2SO4作為色譜分析的流動(dòng)相（0.6mL/min流速）。

1.4 廢紙制備

廢紙切成尺寸為1 cm×1 cm，在溫度60℃去離子水中浸漬6 h，漿濃為10 g/L，溫和地?cái)嚢枰匀コ湍?。多次反?fù)擠壓以除去水分；然后，將浸漬后的廢紙置于溫度50℃烘箱中干燥24 h。烘干的廢紙樣用磨機(jī)碎解處理5 min，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，以消除纖維素結(jié)構(gòu)的物理障礙；最后，廢紙用溫度60℃的稀磷酸（3 g/L）處理2 h，用去離子水洗至pH呈中性；然后，在干燥箱中烘干至恒量，溫度控制在50℃。

1.5 酶消化試驗(yàn)

由里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38恢復(fù)活力的粗酶首先采用凍干濃縮，并懸浮于20 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.8）中，再經(jīng)混合得到最終的酶濃度如下：活性3.5 U/mL的FP酶，1.5 U/mL的內(nèi)切葡聚糖酶，20 U/mL的β-葡萄糖苷酶和80 U/mL的木聚糖酶。這種混合物同時(shí)與其他工業(yè)纖維素酶（Novo 342，Danimax 89-2，Kamaistone K-050和Cellusoft）進(jìn)行對(duì)比，測(cè)試其用于預(yù)處理廢紙生產(chǎn)可發(fā)酵糖的能力。取1 g預(yù)處理的廢紙（辦公廢紙，舊報(bào)紙）在溫度40℃下以不同纖維素酶培養(yǎng)，完成生物質(zhì)的酶解糖化。具體步驟如下：在250mL具塞燒瓶中加入廢紙樣和酶，并加入50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.8），使總液體體積為50mL。用一個(gè)可控?cái)嚢杵骺刂茻績(jī)?nèi)攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min。所有纖維素酶的用量都固定為10 FPU/g（干物質(zhì)）。發(fā)酵培育48 h后，從產(chǎn)物中取樣，以6 000 r/min離心分離10min，上層清液用于分析總還原糖，用DNS法測(cè)定。

糖化率計(jì)算公式：

在所有的分析測(cè)定中至少有3組平行樣品，數(shù)據(jù)取3次測(cè)定值的平均值。

1.6 表面活性劑預(yù)處理對(duì)酶消化率的影響

表面活性劑預(yù)處理方法如下：稱取10 g預(yù)處理的辦公廢紙和舊報(bào)紙放入500mL燒瓶中，加200 g去離子水；加入0.5%（對(duì)絕干廢紙質(zhì)量）表面活性劑（吐溫20、吐溫80、Triton X-100、SDS和PEG 6000）于燒瓶中，溫度40℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，攪拌2 h。預(yù)處理后，濕的固體進(jìn)行離心分離，用3 L去離子水徹底洗滌以去除表面活性劑；然后，在干燥箱中干燥，溫度50℃，過(guò)夜。酶消化率的測(cè)定方法如上所述。

1.7 廢紙水解發(fā)酵制乙醇

所有的發(fā)酵試驗(yàn)都使用釀酒酵母CTM-30101。辦公廢紙采用單獨(dú)糖化發(fā)酵（SHF）生產(chǎn)乙醇，廢紙水解糖化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾消毒滅菌后作為發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)在1 L三角瓶中進(jìn)行，加入200 mL補(bǔ)充了氮源的培養(yǎng)液，形成YMP培養(yǎng)基（含3 g/L酵母提取物，3 g/L麥芽提取物和5 g/L蛋白胨）。三角瓶接種5%的酵母菌懸液，酵母菌懸液是在含有10 g/L的酵母提取物、10 g/L蛋白胨及20 g/L的葡萄糖的YPG培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 h而獲得。空白對(duì)比發(fā)酵也是用YMP培養(yǎng)基，但補(bǔ)充加入試劑級(jí)葡萄糖使其達(dá)到用于廢紙單獨(dú)糖化發(fā)酵過(guò)程的水解產(chǎn)物的相同濃度。在溫度30℃下進(jìn)行，150 r/min回轉(zhuǎn)式震蕩下培養(yǎng)繁殖。樣品72 h后收集，并在12 000 r/min離心10min。無(wú)微生物細(xì)胞的上層清液用于測(cè)定產(chǎn)生的乙醇和糖的消耗。細(xì)胞生長(zhǎng)情況由讀取光密度來(lái)直接監(jiān)測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法生產(chǎn)廢紙水解酶制劑

表1顯示了粗纖維素酶的生產(chǎn)水平和BGL的里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38分別經(jīng)過(guò)5天的培養(yǎng)情況［表中，總纖維素酶活（FP）、CMC、p NPG和木聚糖酶活性（木聚糖）作為酶活性的測(cè)定底物］。

表1 里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38培養(yǎng)5天產(chǎn)生粗纖維素酶

Rut C-30纖維素酶可用于估計(jì)濾紙的酶活性（1.14 U/mL）和CMC酶的活性（0.76 U/mL），但BGL酶活性（0.22 U/mL）較小。相反地，黑曲霉酶有較小的濾紙酶活（0.24 U/mL）和CMC酶活（0.33 U/mL），而B(niǎo)GL酶活達(dá)到6.8 U/mL，高出了數(shù)倍。里氏木霉是一種絲狀真菌纖維素酶，但它具有低的BGL酶活性，導(dǎo)致纖維二糖積累，它在水解過(guò)程中產(chǎn)生抑制，是最終產(chǎn)物的抑制劑。值得注意的是，添加BGL以減小纖維二糖酶的抑制作用。

另一方面，木聚糖酶活性主要由2種培養(yǎng)方法獲得。這種酶可能在半纖維素降解過(guò)程中起重要作用。許多研究者報(bào)道了木聚糖酶是一種能夠顯著提高纖維素酶水解纖維素活性的酶劑，而半纖維素被認(rèn)為是纖維素水解的障礙物質(zhì)，阻礙酶進(jìn)入纖維素。

2.2 廢紙組成

表2是廢紙（辦公廢紙、舊報(bào)紙）的生化特性分析結(jié)果（分別4個(gè)平行試樣并分別標(biāo)記為序號(hào)1～4）。

表2 廢紙的生化特性分析結(jié)果w/%

表2列出了不同的研究所測(cè)定得出的辦公廢紙中纖維素含量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)從55.7%～87.4%不等，最高纖維素含量為87.4%；最低的半纖維素和木素含量分別為4.7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)和0.93%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這一特性更適合糖化發(fā)酵生產(chǎn)，因?yàn)樯倭康陌肜w維素和木素對(duì)酶法水解纖維素產(chǎn)生較小阻礙作用。有研究曾測(cè)定出辦公廢紙的纖維素含量較低（55.7%），可能是因廢紙樣品中有無(wú)機(jī)物涂布紙（含量達(dá)13%）。另有研究證實(shí)，不僅原生紙漿會(huì)影響纖維素含量，而且不同的測(cè)定方法也影響其生化成分的測(cè)定結(jié)果。鑒于此，必須選擇適宜的方法，盡可能使碳水化合物的損失量控制在最小范圍內(nèi)。

由表2還可見(jiàn)，與辦公廢紙相比，舊報(bào)紙含有較多的木素（23.9%）和半纖維素（18.1%），纖維素含量較少（43.7%）。舊報(bào)紙的這一組成特點(diǎn)使纖維素水解程度受限，不過(guò)可通過(guò)使用多種水解酶協(xié)同作用來(lái)克服。

2.3 酶消化試驗(yàn)

在使用酶以前對(duì)酶制劑的水解性能進(jìn)行評(píng)估是很有必要的。圖1是使用不同的纖維素酶水解反應(yīng)48 h后的糖化度。

圖1 不同纖維素酶水解反應(yīng)48 h后的糖化度

由圖1可知，酶混合物和纖維素酶Kamaistone K-050表現(xiàn)出較好的功能穩(wěn)定性，并分別能夠保留約66%和71%初始活性。其原因可能是由于它們有良好的熱穩(wěn)定性。操作穩(wěn)定性是酶在工業(yè)應(yīng)用中非常理想的特性，特別有利于連續(xù)糖化過(guò)程和顯著降低纖維素乙醇發(fā)酵的生產(chǎn)成本。值得注意的是，這2種酶制劑分別來(lái)自里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38，他們協(xié)同使用比單獨(dú)使用能顯著提高廢紙的水解率（數(shù)據(jù)未顯示）。這表明混合酶非常適合廢紙的糖化發(fā)酵。

2.4 表面活性劑預(yù)處理對(duì)酶消化率的影響

眾所周知，添加表面活性劑對(duì)木質(zhì)纖維素酶水解有顯著改善作用；然而，以往的研究是在水解階段加入表面活性劑。本研究選擇了5種不同的表面活性劑，考察了當(dāng)表面活性劑用量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%時(shí)纖維素酶解對(duì)廢紙中木質(zhì)纖維原料的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同的表面活性劑對(duì)預(yù)處理后廢紙中纖維素糖轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可見(jiàn)：所有表面活性劑均能提高舊報(bào)紙的水解效率，但辦公廢紙水解效率無(wú)明顯提高；Triton X-100用量0.5%時(shí)能提高舊報(bào)紙消化率約45%。Triton X-100是非離子型表面活性劑，可顯著提高廢紙或再生紙的糖化率。如圖2所示，由于舊報(bào)紙中木素含量相對(duì)較高，木素對(duì)纖維素酶解有一定的影響，會(huì)抑制纖維素酶解能力，可通過(guò)在酶解液中添加表面活性劑加以改善。研究者認(rèn)為，表面活性劑的加入主要是減少木素對(duì)纖維素酶的吸附作用。已經(jīng)有研究者提出了幾種機(jī)理作用，表面活性劑的加入可以顯著提高纖維原料的纖維素糖轉(zhuǎn)化率，且底物中木素含量越高，其纖維素轉(zhuǎn)化率的提高幅度也越大。而辦公廢紙含相對(duì)較低的木素可以解釋表面活性劑預(yù)處理后相對(duì)較低的糖轉(zhuǎn)化量，只有Triton X-100預(yù)處理后舊報(bào)紙可以維持較高的糖轉(zhuǎn)化率。

2.5 廢紙水解產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵

研究發(fā)現(xiàn)辦公廢紙生產(chǎn)乙醇產(chǎn)量高于以往以造紙污泥作為原料生產(chǎn)乙醇。底物用木糖發(fā)酵酵母在以分步糖化發(fā)酵（SHF）和同步糖化發(fā)酵（SSF）工藝下培育72 h。SHF法可以達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，乙醇產(chǎn)率相當(dāng)于1 g總糖約得到0.27 g乙醇。

在YMP介質(zhì)對(duì)比發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和乙醇有類似的表現(xiàn)。最大的乙醇質(zhì)量濃度（9.6 g/L）比SHF法稍高，經(jīng)36 h培育后，可獲得相當(dāng)于產(chǎn)量為0.26 g乙醇每升每小時(shí)和0.42 g乙醇每克總糖。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)或酒精發(fā)酵有細(xì)微差異，結(jié)果表明，辦公廢紙的水解物無(wú)任何顯著抑制微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)。

圖3顯示了2個(gè)典型的發(fā)酵工藝過(guò)程中水解時(shí)間與葡萄糖濃度、乙醇濃度和磷酸預(yù)處理關(guān)系（圖中：SHF工藝，“■”為葡萄糖，“●”為乙醇，“▲”為增長(zhǎng)水平；對(duì)照工藝YMP，“□”為葡萄糖，“○”為乙醇，“△”為增長(zhǎng)水平。

圖3 2個(gè)典型的發(fā)酵工藝過(guò)程中水解時(shí)間與葡萄糖濃度、乙醇濃度和磷酸預(yù)處理的關(guān)系

3 結(jié)論

舊報(bào)紙和辦公廢紙可作為可發(fā)酵糖的生產(chǎn)原料，SHF可以使降解的糖轉(zhuǎn)化為乙醇。由里氏木霉Rut C-30和黑曲霉F38培育的纖維素酶和BGL，分別證明了糖化發(fā)酵廢紙生產(chǎn)乙醇的可行性。在最優(yōu)水解條件下，從廢紙中釋放的糖隨后被生物轉(zhuǎn)化為乙醇。

（張俊苗編譯）