陸恩澤，林志松，朱濱△，邢軍芬

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 電氣與電子工程學(xué)院，上海 201418；2.上海百傲科技股份有限公司 上海 201418)

1 引 言

生物芯片技術(shù)是近些年產(chǎn)生的一項(xiàng)生物高新技術(shù)，它以載玻片，塑料片或者硅片為介質(zhì)，上面固定了大量按特定方式和手段排列的核酸片段作為探針，探針代表了特定的基因信息[1-2]。其主要用于疾病的檢測(cè)預(yù)防，用藥指導(dǎo)，食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域[3]。目前市場(chǎng)上的生物芯片根據(jù)探針標(biāo)記方法可分為兩大類：熒光標(biāo)記生物芯片和顯色標(biāo)記生物芯片，由于顯色標(biāo)記芯片的原料易得、制作成本低，并且顯色芯片檢測(cè)設(shè)備價(jià)格低廉、穩(wěn)定性好，顯色生物芯片逐漸成為市場(chǎng)主流。生物芯片與生物靶標(biāo)進(jìn)行反應(yīng)后，可以獲得人體內(nèi)生物靶標(biāo)的各種信息并以圖像呈現(xiàn)，生物芯片識(shí)讀儀對(duì)圖像進(jìn)行采集、分析、處理，并輸出人體內(nèi)生物靶標(biāo)的各種信息。

目前同類型顯色生物芯片識(shí)圖像讀儀配套軟件存在一些缺陷，比如上海百傲科技生產(chǎn)的第二代生物芯片識(shí)讀儀是將掃描得到的圖片通過(guò)USB數(shù)據(jù)線傳輸?shù)絇C端，再使用Visual C++編寫的圖像處理程序?qū)D片進(jìn)行分析，然而單獨(dú)使用Visual C++編寫圖像處理程序，代碼較為復(fù)雜。而且對(duì)于微陣列圖像信號(hào)點(diǎn)的識(shí)別和定位，還需以人工手動(dòng)操作的方式進(jìn)行。這無(wú)疑降低了工作效率，一定程度上制約了顯色生物芯片產(chǎn)品的發(fā)展。而且現(xiàn)有的顯色生物芯片識(shí)讀儀軟件，缺乏對(duì)于原始數(shù)據(jù)的記錄保存。鑒于此，我們開(kāi)發(fā)了一套新型顯色生物芯片識(shí)讀儀配套軟件。本軟件在Linux嵌入式系統(tǒng)下使用，配置了opencv的eclipse編寫圖像處理程序。opencv是開(kāi)源發(fā)型的計(jì)算機(jī)視覺(jué)庫(kù)，支持Windows和Linux操作系統(tǒng)，具有優(yōu)化代碼，統(tǒng)一結(jié)構(gòu)和強(qiáng)大的圖像和矩陣運(yùn)算能力，減少圖像處理算法難度[4]。

2 生物芯片識(shí)讀儀系統(tǒng)簡(jiǎn)介

前期已自主研制了基于CCD的顯色生物芯片識(shí)讀儀，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)本研究所報(bào)道的識(shí)讀配套軟件，配套軟件由分析軟件和判型軟件構(gòu)成。芯片識(shí)讀儀通過(guò)CCD工業(yè)相機(jī)拍攝生物芯片生成原始圖像，圖像以BMP格式存儲(chǔ)。每張芯片貼有CODE128條形碼，條形碼代表芯片圖像的陣列信息，識(shí)讀儀掃描條碼信息傳遞給分析軟件，分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理分析。本圖像分析軟件是在CCD相機(jī)中運(yùn)行的，直接在識(shí)讀儀內(nèi)部對(duì)生物芯片圖像進(jìn)行處理分析，最終輸出相關(guān)基因信號(hào)點(diǎn)的強(qiáng)度值。識(shí)讀儀與PC端通過(guò)有線以太網(wǎng)連接進(jìn)行數(shù)據(jù)傳遞。分析數(shù)據(jù)傳遞到PC端，根據(jù)生物芯片產(chǎn)品的類型以及獲得的信號(hào)值進(jìn)行基因判型。軟件的硬件拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 軟件硬件拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖

3 識(shí)讀儀圖像分析軟件架構(gòu)設(shè)計(jì)

圖像分析軟件主要是實(shí)現(xiàn)基因信號(hào)點(diǎn)的精準(zhǔn)讀值[5]。從軟件功能上來(lái)講，本研究設(shè)計(jì)的圖像分析軟件思路是對(duì)原始圖像進(jìn)行預(yù)處理，從而完成信號(hào)點(diǎn)識(shí)別和坐標(biāo)信息提取，最終根據(jù)坐標(biāo)信息讀取原始圖像信號(hào)點(diǎn)真實(shí)值。軟件還應(yīng)具備信息存儲(chǔ)功能，以及實(shí)現(xiàn)軟件與PC端的通信。見(jiàn)圖2。

圖2 圖像分析軟件架構(gòu)

4 生物芯片圖像處理與分析：

4.1 圖像預(yù)處理

圖像預(yù)處理是為了實(shí)現(xiàn)信號(hào)點(diǎn)準(zhǔn)確定位。生物芯片是通過(guò)高精度的點(diǎn)樣儀制備的，因此，信號(hào)點(diǎn)的區(qū)域位置和機(jī)械尺寸是固定的。本軟件先對(duì)原始圖像(圖3)裁剪取出成像ROI區(qū)域，ROI區(qū)域的提取減少了圖像處理工作量。接著使用亮度歸一化方法增強(qiáng)信號(hào)點(diǎn)與背景的對(duì)比度，有效提高了輪廓識(shí)別效果。亮度進(jìn)行歸一化采用直方圖均衡法，本研究使用了opencv中的cvEqualizeHist函數(shù)用于此操作。接著對(duì)歸一化后的圖像進(jìn)行反色二值化，由于生物芯片圖像的每個(gè)信號(hào)點(diǎn)強(qiáng)度值不一，且受背景光源的影響導(dǎo)致背景不均勻，在此采用局部自適應(yīng)閾值法對(duì)反色后的圖像進(jìn)行二值化，閾值由局部鄰域塊高斯加權(quán)得出。根據(jù)本生物芯片圖像信號(hào)點(diǎn)大小，通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定局部鄰域塊大小為15。

圖3 顯色生物芯片圖像

生物芯片圖像的噪聲主要來(lái)源于芯片制備過(guò)程中灰塵的污染，雜交的實(shí)驗(yàn)污染，待檢測(cè)樣品中核酸，蛋白質(zhì)，細(xì)胞或組織碎片的干擾，以及識(shí)讀儀使用過(guò)程中的污染[6]。圖像的噪聲影響信號(hào)點(diǎn)的識(shí)別和定位，因此圖像去噪至關(guān)重要。根據(jù)顯色生物芯片圖像噪聲特點(diǎn)，本軟件使用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)運(yùn)算[7]對(duì)圖像進(jìn)行去噪，運(yùn)算方法為開(kāi)運(yùn)算，內(nèi)核的形狀為圓形。圖4為對(duì)圖3預(yù)處理后的效果圖。

圖4 預(yù)處理后二值化圖像

4.2 信號(hào)點(diǎn)識(shí)別

本研究在圖像預(yù)處理中使用亮度歸一化，增強(qiáng)了前后景對(duì)比度，因此，信號(hào)點(diǎn)識(shí)別中主要使用輪廓搜索的方法。使用Canny邊緣檢測(cè)算法進(jìn)行邊緣檢測(cè)，同時(shí)使用opencv提供的cvFindContours()函數(shù)搜尋信號(hào)點(diǎn)輪廓。形態(tài)學(xué)去噪并不能完全消除噪聲的影響，圖4中依然會(huì)存在噪點(diǎn)。軟件在輪廓搜索時(shí)勢(shì)必會(huì)取到灰塵輪廓，導(dǎo)致對(duì)信號(hào)點(diǎn)的坐標(biāo)定位錯(cuò)誤。通過(guò)大量生物芯片圖像分析可見(jiàn)，灰塵輪廓遠(yuǎn)小于信號(hào)點(diǎn)輪廓，且噪點(diǎn)所處的位置不在陣列位置上(見(jiàn)圖4)。本軟件搭建了配置文件處理模塊，文件中設(shè)置了信號(hào)點(diǎn)識(shí)別與信號(hào)點(diǎn)取值所需的配置參數(shù)。軟件對(duì)所有輪廓進(jìn)行搜索排序，篩選出輪廓大小符合設(shè)定閾值的信號(hào)點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)輪廓中心位置，使用opencv中的cvBoundingRect()計(jì)算出該輪廓的外接矩形記為rect，該矩形的位置和長(zhǎng)寬分別為rect.x，rect.y，rect.width和rect.height，則輪廓中心坐標(biāo)公式為(rect.x+rect.width/2, rect.y-rect.height/2)。

4.3 信號(hào)點(diǎn)定位

本軟件運(yùn)行的識(shí)讀儀在掃描過(guò)程中自動(dòng)讀取芯片條碼信息，其代表芯片圖像的陣列信息。本軟件根據(jù)條碼信息實(shí)現(xiàn)信號(hào)點(diǎn)自動(dòng)定位代替人工輸入陣列信息的步驟，有效避免自動(dòng)定位的錯(cuò)誤。見(jiàn)圖3，本軟件處理的所有生物芯片圖像均存在最左邊3列標(biāo)志列，而其他列探針區(qū)域信號(hào)點(diǎn)不一定顯色,而熒光生物芯片探針區(qū)域均有強(qiáng)度值不一的熒光點(diǎn)。在本設(shè)計(jì)中，軟件先確定三列質(zhì)控點(diǎn)位置，再定位其他信號(hào)點(diǎn)。若采用文獻(xiàn)[8]所示的基于圖像投影定位方法，當(dāng)存在大面積未消除背景噪聲時(shí)會(huì)定位失敗。而本軟件算法會(huì)對(duì)找到的每個(gè)點(diǎn)輪廓遍歷搜索鄰居點(diǎn)，根據(jù)點(diǎn)的坐標(biāo)值判斷是否為某種間距的點(diǎn)陣，再找點(diǎn)陣中的最左列和最上行，最后確定標(biāo)志列區(qū)域位置，再根據(jù)配置文件預(yù)設(shè)行列間距生成虛擬定位網(wǎng)格。對(duì)其他確定位置點(diǎn)陣各列各行點(diǎn)的分別計(jì)算橫縱坐標(biāo)值和虛擬定位網(wǎng)格線坐標(biāo)值的差值，按誤差最小來(lái)擬合某行和某列的垂直線和水平直線，實(shí)現(xiàn)對(duì)虛擬網(wǎng)格線坐標(biāo)的修正。按照此算法實(shí)現(xiàn)的信號(hào)點(diǎn)識(shí)別和定位效果見(jiàn)圖5。

圖5 信號(hào)點(diǎn)識(shí)別和定位結(jié)果

4.4 信號(hào)點(diǎn)取值

本軟件對(duì)信號(hào)點(diǎn)區(qū)域透光率值從大到小排序，根據(jù)配置文件設(shè)定的正常透光率范圍閾值參數(shù)，剔除超過(guò)正常透光范圍的像素點(diǎn)，計(jì)算其余像素點(diǎn)透光率的平均值，作為該信號(hào)點(diǎn)區(qū)域的透光率，從而能排除灰塵噪點(diǎn)干擾準(zhǔn)確取值。在選取背景值上，軟件對(duì)框定背景范圍內(nèi)所有像素點(diǎn)的透光率值，將其從小到大排序，取透光率最大的5%的像素點(diǎn)平均值做為全局背景值。再使用同樣方法對(duì)每個(gè)信號(hào)點(diǎn)所在大小為15像素局部塊區(qū)域計(jì)算得出局部背景值。比較局部背景值與全局背景值的差異，當(dāng)受到噪聲影響差值大于閾值時(shí)，選擇全局背景值進(jìn)行計(jì)算。實(shí)際輸出信號(hào)值計(jì)算公式如下：

式中v代表輸出信號(hào)值，f為前景信號(hào)值，bj為局部背景值，bq為全局背景值，th為本軟件設(shè)定的差值閾值。

4.5 數(shù)據(jù)輸出模塊

數(shù)據(jù)輸出模塊將所有的信號(hào)點(diǎn)位置和取值信息輸出到Linux系統(tǒng)下搭建的samba服務(wù)器的共享文件夾中，同時(shí)輸出原始圖像，格式為BMP。PC端軟件根據(jù)識(shí)讀儀的IP地址通過(guò)網(wǎng)上鄰居獲取相關(guān)數(shù)據(jù)文件。

4.6 配置文件模塊

配置文件使用LUA腳本，其中定義了信號(hào)點(diǎn)定位與取值所需的相關(guān)配置參數(shù),本軟件在進(jìn)行一系列圖像處理分析過(guò)程中均會(huì)調(diào)用此配置文件。Lua腳本可以很容易的被C/C++ 代碼調(diào)用，也可以反過(guò)來(lái)調(diào)用C/C++的函數(shù)，這使得Lua在應(yīng)用程序中可以被廣泛應(yīng)用。不僅作為擴(kuò)展腳本，也可以作為普通的配置文件，代替XML,ini等文件格式，并且更容易理解和維護(hù)。

5 基因判型軟件

設(shè)備讀取的信號(hào)值最終傳送到PC端基因判型軟件，基因判型軟件根據(jù)芯片的類型，將信號(hào)值填入相應(yīng)內(nèi)嵌公式的excel模板表格，自動(dòng)計(jì)算各探針點(diǎn)信號(hào)比值，通過(guò)與實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)確定的純合/雜合基因判定閾值[9]進(jìn)行比較分析，判定所檢測(cè)各基因類型并自動(dòng)以表格形式輸出結(jié)果。

6 顯色生物芯片識(shí)讀儀圖像分析軟件的開(kāi)發(fā)工具

本圖像軟件使用ANSI C語(yǔ)言開(kāi)發(fā)，使用GCC編譯器，程序開(kāi)發(fā)IDE工具為Eclipse，開(kāi)發(fā)環(huán)境為L(zhǎng)inux。使用C語(yǔ)言開(kāi)發(fā)能保證在大數(shù)據(jù)量的圖像處理工作中，保持比較高的運(yùn)行效率。本軟件在圖像處理過(guò)程中還調(diào)用了opencv庫(kù)函數(shù)?；蚺行蛙浖赪indows環(huán)境下使用Visual C++開(kāi)發(fā)。

7 軟件可靠性論證實(shí)驗(yàn)

在本實(shí)驗(yàn)中，分別用批準(zhǔn)上市的BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀(滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第2400062號(hào))軟件和本文設(shè)計(jì)的生物芯片識(shí)讀儀軟件對(duì)來(lái)自臨床實(shí)驗(yàn)室的三種(CYP2C19、MTHFR、ALDH2)顯色型基因芯片產(chǎn)品各200張進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果按照kappa檢驗(yàn)法[10]分析。分別得到4組kappa系數(shù)，以此評(píng)價(jià)軟件性能的一致性，結(jié)果如下：

(1)CYP2C19檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于636位點(diǎn)，兩者均檢出的有195例，兩者檢測(cè)結(jié)果100%相同，其中GG型178例，AG型17例，AA型0例，kappa系數(shù)為1。對(duì)于681位點(diǎn)[9]，兩者均檢出的有197例，兩者檢測(cè)結(jié)果100%相同，其中GG型89例，AG型92例，AA型16例，kappa系數(shù)為1。

(2)MTHFR檢測(cè)結(jié)果

兩者均檢出的有188例，兩者檢測(cè)結(jié)果100%相同，其中CC型49例，CT型89例，TT型50例，kappa系數(shù)為1。

(3)ALDH2檢測(cè)結(jié)果

兩者均檢出的有190例，兩者檢測(cè)結(jié)果100%相同，其中Glu504Glu型129例，Glu504Lys型55例，TT型6例，kappa系數(shù)為1。

表1是二者檢出率的比較。本研究設(shè)計(jì)的軟件檢出率略優(yōu)于已上市產(chǎn)品BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀軟件。判型的準(zhǔn)確性從側(cè)面論證本軟件的信號(hào)點(diǎn)識(shí)別定位以及讀值準(zhǔn)確性，因此，本研究設(shè)計(jì)的軟件是可靠的。

表1 檢出率對(duì)比

8 結(jié)論

本軟件系統(tǒng)分為嵌入式圖像分析軟件和PC端判型軟件，嵌入式軟件通過(guò)讀取條碼信息實(shí)現(xiàn)了在識(shí)讀儀掃描過(guò)程中自動(dòng)輸出相關(guān)數(shù)據(jù)，PC端軟件通過(guò)調(diào)取掃描數(shù)據(jù)直接輸出檢測(cè)結(jié)果。這一配套軟件數(shù)據(jù)輸出準(zhǔn)確，使用方便，分析效率高，可在以玻璃材質(zhì)為載體的顯色生物芯片識(shí)讀儀上推廣使用，并為顯色生物芯片圖像分析軟件設(shè)計(jì)提供思路。