王　莉，羅穎鵬，羅小虎，王　韌，李永富，李亞男，邵慧麗，陳正行*

（江南大學食品學院，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

臭氧降解污染小麥中嘔吐毒素的效果及降解產(chǎn)物推測

王莉，羅穎鵬，羅小虎，王韌，李永富，李亞男，邵慧麗，陳正行*

（江南大學食品學院，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

利用臭氧降解小麥中的嘔吐毒素，通過超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC Q-TOF MS）測定了純水體系中嘔吐毒素的臭氧降解產(chǎn)物。結果表明：全麥粉中的嘔吐毒素降解率顯著高于小麥籽粒。當小麥水分含量為20.10%，臭氧質量濃度為100 mg/L，處理60 min后，嘔吐毒素含量由3.89 mg/kg 降到了0.83 mg/kg。建立的一級動力學方程顯示臭氧反應速率為k100mg/L＞k75mg/L＞k50mg/L＞k25mg/L。根據(jù)UPLC Q-TOF MS得到離子碎片信息提出了可能的離子碎片生成途徑并推測了臭氧降解產(chǎn)物結構，5 種主要產(chǎn)物的m/z分別為344.948 1、329.205 0、311.191 8、311.190 7和346.240 4。

小麥；嘔吐毒素；臭氧；動力學；降解產(chǎn)物

嘔吐毒素學名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是鐮刀菌的一種次級代謝產(chǎn)物，特別是禾谷鐮刀菌，會引起小麥赤霉菌［1-2］。DON會抑制蛋白質的合成，導致嘔吐、腹瀉、厭食、神經(jīng)紊亂等毒性效應［3-5］。由于氣候、環(huán)境等條件的原因，很難避免DON污染糧食，且普通的加工方式很難將其破壞。常用的物理方法［6-9］降解效率不高；化學方法［10］常用堿處理等化學試劑處理，會有化學殘留；生物法因其反應條件溫和，能改善產(chǎn)品的品質，但成本較高。因此，尋找一種安全有效、可應用的DON消減方法仍非常必要。

臭氧可迅速破壞有機物中的雙鍵，形成含雙鍵少、分子質量較低的物質；且臭氧可自動分解成氧氣，沒有毒性殘留。1997年，臭氧被美國鑒定為一般認為安全物質，并被食品藥品監(jiān)督管理局證明可以直接加入到食品中［11］。另外，前人大量的研究證明臭氧能夠高效地去除花生、玉米、無花果、小麥等糧食中的黃曲霉毒素［12-15］。與臭氧處理黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）相比，DON的臭氧處理研究相對較少，而關于其臭氧降解產(chǎn)物的研究更是鮮有報道。超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC Q-TOF MS）在研究毒素降解產(chǎn)物方面已被廣泛應用。刁恩杰等［16］利用UPLC Q-TOF MS研究乙腈溶液中的AFB1臭氧降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了6 種主要降解產(chǎn)物，推測了它們的結構并提出了可能的AFB1臭氧降解途徑。Luo Xiaohu等［17-18］用該儀器分別分析臭氧水溶液和干臭氧處理AFB1可能的降解產(chǎn)物，推測了相應的產(chǎn)物結構以及降解途徑。Liu Ruijie等［19］也利用該儀器做了AFB1光降解產(chǎn)物的研究。證明UPLC Q-TOF是一種有效地推測產(chǎn)物結構的工具。

本實驗研究了不同條件下臭氧對污染小麥中DON的降解效果，并建立相應的一級動力學方程，以期為臭氧降解DON的實際應用提供理論基礎。同時，推測了臭氧降解產(chǎn)物的結構，對于評價產(chǎn)物的毒性有重要的意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

DON自然污染小麥 市購；DON標準品（CAS：51481-10-8，純度≥99%）、乙腈（色譜純） 百靈威科技有限公司；Mycosep 227# Trch+固相萃取柱 美國Romer Labs公司；除特別說明，其他試劑均為分析純國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

通過臭氧發(fā)生器 中國青島國林有限公司；1260系列高效液相色譜儀（帶紫外檢測器）、ZORBAXSB-C18柱美國Agilent科技有限公司；Ideal 2000臭氧分析記錄儀 中國淄博測量控制有限公司；Acquity UPLC儀、Synapt Q-TOF MS質譜儀、UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；Millipore-Q SP超純水儀 美國Millipore公司；HYGA全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠。

1.3方法

1.3.1臭氧處理小麥樣品

挑出雜質后取一定量樣品充分混勻，通過四分法取100 g小麥籽?；蛘呷湻郏ㄟ^孔徑為0.6 mm篩）置于一個玻璃反應器中。臭氧氣體先從反應器底部進入，從頂端排出。反應器的底部鋪滿了玻璃珠，目的是使臭氧氣體分布均勻。玻璃珠上面是待處理的物料，兩者之間由鋼絲網(wǎng)隔開。臭氧流速為2 L/min不同水分含量（11.79%、16.29%、20.10%）的樣品用不同質量濃度的臭氧（0、25、50、75、100 mg/L）處理，環(huán)境溫度與濕度分別為25℃、75%。每個樣品處理時間分別為0、15、30、45、60 min。殘余的臭氧氣體通過尾氣分解器分解成氧氣排出，所有處理后的樣品在4 ℃條件下儲藏，待測。

1.3.2DON檢測［20］

1.3.2.1樣品處理

取25 g樣品置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL乙腈-水（84∶16，V/V），在200 r/min的搖床上劇烈振蕩30 min，得到提取液，布氏漏斗過濾，收集濾液。取上述濾液4 mL，由Mycosep 227# Trch+凈化柱凈化，用塑料管收集2 mL 凈化液，在50 ℃條件下N2吹干。殘余物用1mL乙腈-水（6∶94，V/V）復溶，渦旋振蕩30 s。復溶液過0.22 μm 濾膜，并在4 ℃條件下儲藏，待高效液相色譜分析。

1.3.2.2液相色譜測定方法

儀器為安捷倫1260系列，可變波長紫外檢測器。檢測波長為218 nm，色譜柱為安捷倫ZORBAXSB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。檢測時柱溫維持在35 ℃，流速0.8 mL/min，流動相為乙腈-水（6:94，V/V），進樣量10 μL，檢測時間20 min。

1.3.3降解率計算

臭氧處理DON降解率的計算公式為：

式中：c（A，t）為樣品中DON經(jīng)臭氧處理t時間后的初始含量/（mg/kg）；c（A，0）為樣品中DON的初始含量/（mg/kg）。

1.3.4動力學模型

一級動力學模型建立方法參考羅小虎等［21］的文獻。

1.3.5DON臭氧降解產(chǎn)物分析

1.3.5.1臭氧處理DON標準品

取1 mL 40 mg/L的標準工作液到EP管中，40 ℃條件下氮氣吹干后，1 mL超純水復溶。按同樣的方法得到若干個樣品。將質量濃度為10 mg/L的臭氧氣體直接通入樣品溶液中，分別處理0、0.5、1、1.5、3 min和5 min。

1.3.5.2UPLC Q-TOF MS條件

UPLC條件：配置自動進樣器，二元溶液梯度系統(tǒng)，紫外檢測器的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)，分離柱為UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。流動相組成為：乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）。采用梯度洗脫模式進行檢測，流動相梯度配比為：0 min 5% A，95% B；0.5 min 5% A，95% B；10 min 70% A，30% B；12 min 100% A；12.1 min A流動相迅速降為5%，并維持2 min。整個進樣分析過程耗時15 min；進樣量0.5 μL；流速300 μL/min；柱溫45 ℃。

MS條件：質譜儀的檢測由配備電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源的Waters Synapt Q-TOF系統(tǒng)在陽離子（positive ionization，PI）模式下實現(xiàn)的。其實驗條件如下：3.0 kV的毛細管電壓，30 V錐孔電壓，100 ℃離子源溫度，和400 ℃的脫溶劑氣體溫度。錐孔和脫溶劑氣體的氣流速度分別為50 L/h和500 L/h。質核比掃描范圍m/z 50～800，碰撞能量6 eV。

1.4統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理

所有試驗都重復至少3 次，圖形由Origin 8.6繪制；質譜圖數(shù)據(jù)由工作站Masslynx V4.1及MassFragment處理完成。

2　結果與分析

2.1不同處理條件對臭氧降解DON效果的影響

2.1.1水分含量對臭氧降解DON效果的影響

圖1表明水分含量是影響小麥中DON降解率的關鍵因素。11.79%、16.29%和20.10%這3 種水分含量的樣品中DON的初始含量分別為3.98、3.93 mg/kg和3.89 mg/kg。很明顯，圖中水分含量為11.79%的全麥粉，在100 mg/L的臭氧質量濃度條件下處理1h，所得降解率為47.42%；當水分含量為20.10%時DON的降解率則上升到了78.55%。可能是因為水分的存在提高了臭氧的氧化能力，增加了它的滲透性。Tiwari等［22］認為濕度條件可能會減慢臭氧在物料層的運動，相當于延長了臭氧與毒素的接觸時間。Young等［10］得出濕臭氧對小麥中DON的影響甚微，可能是因為小麥的水分含量過低（約為12%）或者是物料顆粒太大而不能與臭氧發(fā)生充分反應。在Young［23］的另外一篇論文中，當濕玉米（水分含量50%）和飽和水溶液臭氧，或者濕玉米與干臭氧反應，污染玉米中的DON有明顯減少。與之相反，當玉米的水分含量太低時，臭氧對DON的影響很小。Dwarakan［24］和Luo Xiaohu［25］等也認為物料水分含量是臭氧降解AFB1的一個重要因素。

2.1.2物料形態(tài)對臭氧降解DON效果的影響

圖1 不同水分含量全麥粉（a）和籽粒（b）中DON臭氧降解效果Fig.1　Efficacy of DON degradation in whole wheat flour （a） and kernels （b） with different moisture contents

圖1a和1b分別反映了全麥粉與小麥籽粒之間的DON降解率，臭氧對全麥粉中的DON降解率明顯優(yōu)于小麥籽粒。水分含量為16.69%的污染小麥，在100 mg/L臭氧質量濃度條件下處理60 min后，前者的DON降解率最高達67.26%，后者僅有50.03%；水分含量為11.79%和20.10%時，同樣條件下處理具有相同的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于全麥粉與臭氧的接觸面積更大，全麥粉更加多孔，臭氧滲透性更好，毒素能更徹底地和臭氧發(fā)生反應。Akbas［26］和Proctor［27］等得到了相反的結論，他們認為在條件相同的情況下，花生粉或者無花果粉中的AFB1減少量要少于籽粒中的毒素減少量?？赡苁且驗榉勰Y成塊，導致臭氧和樣品接觸不充分。另外，還可以有另外一種原因解釋這個現(xiàn)象：小麥中的DON在不同的部位分布是有差異的，而且不同的品種，DON的分布情況也不盡相同［8，28］。本研究籽粒中的DON降解率低可能是因為所選小麥的表面分布的DON較少，而磨成粉后就使得其從內部暴露出來，因而能夠得到較高的降解率。

2.1.3臭氧質量濃度與處理時間對DON降解效果的影響

圖2　20.10%小麥粉（a）與小麥籽粒（b）中DON臭氧降解效果Fig.2　Efficacy of DON degradation in whole wheat flour （a） and kernels （b） with 20.10% moisture content by ozonation

如圖2所示，不同臭氧質量濃度與處理時間對DON的降解有著明顯不同的效果。含水量為20.10%的小麥，分別用0、25、50、75、100 mg/L臭氧處理0、15、30、45、60 min。當處理臭氧質量濃度為100 mg/L，|處理60 min，全麥粉中的DON降解率達到了78.55%（圖2a）；在同樣的條件下，小麥籽粒中的DON降解率僅有58.35%（圖2b），明顯低于小麥籽粒。隨著臭氧質量濃度的提高，處理時間的延長，小麥中 DON的降解率也明顯增加（P＜0.05）。

Young［23］將玉米粉碎后，經(jīng)干臭氧處理15 min，DON降解率達到了65%，處理時間延長到60 min后，降解率升高到了90%。結果與本實驗結果有差異的原因可能是基質、毒素初始含量或水分含量不同，氧氣的不同流速也可能是影響降解效率的原因。Zorlugenc［15］、Luo Xiaohu［24］和Inan［29］等研究也表明隨著處理時間，臭氧質量濃度的提升，玉米、無花果、紅辣椒中的AFB1降解率也隨著增加，和本實驗的研究結果一致。

2.2一級動力學模型

圖3 20.10％小麥粉（a）與籽粒（b）一級動力學擬合曲線Fig.3　First order kinetic fitting curves for whole wheat flour （A） and kernels （B） with 20.10％ moisture content

圖3表示的是20.10%水分含量的小麥其反應時間與不同臭氧質量濃度和物料形態(tài)的ln（c（A，t）/c（A，0））值之間的一級動力學曲線。該曲線都符合動力學模型的特點。DON降解一級動力學模型在其他文獻中也有應用。Vidal［30］和Numanoglu［31］等都建立了熱處理消減DON的動力學模型，他們的研究也同樣在固體物料中執(zhí)行，并對DON降解顯示了較好的適用性，一定程度上支持了本實驗研究結果。

表1　不同處理條件下一級動力學參數(shù)Table1　First order kinetic parameters under different treatment conditions

表1列出了一級動力學模型在不同處理條件下的方程、相關系數(shù)、反應速率常數(shù)、半衰期和顯著性等參數(shù)。表中R2值都大于0.877，顯示了一級動力學模型良好的擬合度。反應速率常數(shù)kA反映地是臭氧與DON反應過程的快慢，kA值越大，則反應越快，達到目標效果的時間越短。從表1可以看出，k100mg/L＞k75mg/L＞k50mg/L＞k25mg/L，k20.10%MC＞k16.29%MC，表明DON隨著臭氧質量濃度、水分含量的升高而出現(xiàn)不斷降低的趨勢，與本實驗研究結果一致。同時，方程中的初始含量c（A，0）和實際反應中的初始含量有著較好的匹配度，說明這個模型對DON的降解有著一定的指導作用。

2.3DON臭氧降解產(chǎn)物推測

2.3.1降解產(chǎn)物色譜圖

圖4　未處理標準品（a）與處理5 min后樣品（b）色譜圖Fig.4　Chromatograms of non-treated standard （a） and 5-min treated sample （b）

從圖4可以看出，DON在5 min內被迅速降解。隨著處理時間的延長，DON的降解率也隨著提高，處理5 min后DON降解率達到了88%。在未處理樣品色譜圖中，只有DON一個單峰存在；用臭氧處理不同時間后，各個色譜圖中出現(xiàn)了多個峰。由此可知，DON在降解的同時，產(chǎn)生了不同的降解產(chǎn)物。從圖4可以觀察到A、B、C、D和E 5種主要降解產(chǎn)物。

2.3.2產(chǎn)物結構分析

臭氧與DON的主要作用方式符合Criegee機制［32-33］。根據(jù)Criegee機制，DON中的C9-C10雙鍵會被臭氧打開，形成環(huán)加成反應，加入3個氧原子，初步形成不穩(wěn)定的分子臭氧化物，最終分解成含有醛酮基團的羰基化合物降解產(chǎn)物結構的分析主要利用了MassFragment軟件。以降解產(chǎn)物B的推測為例，它在質譜圖中它的基準峰是m/z 329.205 4［M+H］+，與此同時還有一系列的特征離子碎片產(chǎn)（圖5c）。主要特征離子碎片有m/z 311.192 2［MH2O］+，283.190 4［M-CH2O2］+，265.175 7［M-CH2O3］+，249.224 3［M-C2H4O3］+，227.235 9［M-C3H4O4］+等。根據(jù)Masslynx軟件中的“Elemental composition”功能，能得到相應碎片可能的分子式組成。因為整個反應過程是在純水系統(tǒng)中進行，只會存在C、H及O三種元素，結合DON的原本結構，就可推測產(chǎn)物B的結構，再將B的結構導入MassFragment軟件。MassFragment會從各種可能性打斷B的結構，分析得到最有可能的各個離子碎片結構（圖6c）。圖5列出了DON及產(chǎn)物的質譜圖，圖6推測了DON及其主要產(chǎn)物在Q-TOF MS中主要離子碎片的生成途徑；此外，由于產(chǎn)物C與D具有相同的離子質量碎片圖譜，推測它們可能是由于空間位置不同而形成的同分異構體。最終得到的A～E 5 種產(chǎn)物的分子式分別為C15H20O9、C15H20O8、C15H20O7（C和D）和C14H18O10，m/z分別為344.948 1、329.205 0、311.191 8、311.190 7和346.240 4。

圖5　DON與降解產(chǎn)物質譜圖Fig.5　Mass spectra of DON and degradation products

圖6　DON與降解產(chǎn)物離子碎片生成途徑Fig.6　Ion fragmentation pathways of DON and degradation products

3　結 論

臭氧質量濃度、物料形態(tài)、處理時間以及物料水分含量是影響臭氧降解DON效果的關鍵因素。全麥粉中的DON降解率明顯高于小麥籽粒。在實驗范圍內，臭氧質量濃度越高、處理時間延長，水分含量的升高都會促進DON的降解，而不同初始DON含量的樣品降解率沒有顯著變化。當全麥粉的水分含量由11.79%增加到20.10%時，DON的最大降解率從47.42%上升到了78.55%，DON含量由3.89 mg/kg降為了0.83 mg/kg，低于國標［34］（GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》）限量1.0 mg/kg。建立的一級動力學模型具有良好的擬合度，動力學常數(shù)，與實驗結果一致。該模型的建立可以對臭氧的實際應用提供一定的理論指導。由于DON結構雙鍵被臭氧破壞，根據(jù)結構活性關系推測，產(chǎn)物的毒性應比DON弱；5 種主要產(chǎn)物結構的推測能對降解產(chǎn)物的安全性評價提供一定的幫助。另外，臭氧降解小麥中DON后的動物實驗等安全性評價仍需要更進一步的研究。

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Efficacy of Deoxynivalenol Detoxification by Ozone Treatment in Wheat and Prediction of Degradation Products

WANG Li， LUO Yingpeng， LUO Xiaohu， WANG Ren， LI Yongfu， LI Yanan， SHAO Huili， CHEN Zhengxing*
（School of Food Science and Technology， National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

In this study， we used ozone to reduce deoxynivalenol （DON） in contaminated wheat， and the ozonation products were deduced using ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC Q-TOF MS）. The results showed that DON content in whole wheat flour decreased more quickly than in wheat kernels. For wheat with a moisture content of 20.10%， DON content was reduced from 3.89 mg/kg to 0.83 mg/kg after 100 mg/L ozone treatment for 60 min. The kinetic model constants with different ozone concentrations showed the decreasing order of k100mg/L＞k75mg/L＞k50mg/L＞k25mg/L， which was consistent with the experimental results. According to the mass spectral and ion fragmentation information from UPLC Q-TOF， possible ozonation products were proposed. The m/z of the major products were 344.948 1， 329.205 0， 311.191 8， 311.190 7 and 346.240 4， respectively.

deoxynivalenol； ozone； kinetic； degradation products

10.7506/spkx1002-6630-201618027

TS210

A

1002-6630（2016）18-0164-07

王莉， 羅穎鵬， 羅小虎， 等. 臭氧降解污染小麥中嘔吐毒素的效果及降解產(chǎn)物推測［J］. 食品科學， 2016， 37（18）: 164-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618027. http://www.spkx.net.cn

WANG Li， LUO Yingpeng， LUO Xiaohu， et al. Efficacy of deoxynivalenol detoxification by ozone treatment in wheat and prediction of degradation products［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 164-170. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201618027. http://www.spkx.net.cn

2016-03-03

公益性行業(yè)（糧食）科研專項（201313005）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203037）；

國家自然科學基金面上項目（31371874；31471616）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101383；31201381；31501579）；江蘇省博士后基金項目（1501078B）；國家國際科技合作專項（2015DFA30540）

王莉（1981—），女，副教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：legend0318@hotmail.com

陳正行（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食精深加工。E-mail：zxchen2007@126.com