陳　婷，徐文斌，洪怡藍，李　丹，奚印慈*

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

響應面法優(yōu)化甜葉菊殘渣中總黃酮提取工藝及抗氧化活性

陳婷，徐文斌，洪怡藍，李丹，奚印慈*

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

研究甜葉菊殘渣中總黃酮的提取工藝，同時測定甜葉菊殘渣中總黃酮的抗氧化活性。首先以乙醇體積分數(shù)、超聲功率和超聲時間為因素進行單因素試驗，找到每個因素的較優(yōu)水平，然后在此基礎上采用Box-Behnken法進行試驗設計，并進行響應面分析，得到提取工藝的數(shù)學模型，預測出最佳提取工藝及最高總黃酮浸提量。結果顯示：甜葉菊殘渣中總黃酮物質的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率420 W、超聲時間42 min，此時總黃酮浸提量為5.928 mg/g，與由數(shù)學模型得到的理論值5.949 mg/g基本符合。抗氧化實驗結果表明，甜葉菊殘渣中總黃酮具有很強的清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和·OH的能力，其半抑制濃度（EC50）相應為7.096、22.065 μg/mL，分別是VC的1.37、1.61 倍，表明甜葉菊殘渣中黃酮類化合物有很好的抗氧化能力。

甜葉菊殘渣；超聲提取；總黃酮；響應面法；抗氧化性

甜葉菊（Stevia rebaudiana）是被稱作“甜菊”、“甜草”原產(chǎn)于南美洲巴拉圭［1］的一種菊科植物，含甜菊糖苷和黃酮類成分［2］。其中甜菊糖苷是一種新型的天然甜味劑［3］，可替代蔗糖，有甜度高、熱量低、安全無毒等特點［4］，已經(jīng)廣泛應用到醫(yī)藥和食品等領域［5］。其具有抗氧化性、抗菌性等功效，且能夠調節(jié)免疫力［6-8］，同時具有很好的軟化血管、降血脂和降血糖等功能［9-10］。目前國內已有對甜葉菊中甜菊糖苷提取方面的研究［11］，其發(fā)酵制劑抗氧化活性的研究也有報道［12］；但甜葉菊殘渣中總黃酮的提?。?3］并鑒定其抗氧化活性卻鮮有報道。

本實驗以甜葉菊殘渣為試驗原料，先運用Box-Behnken試驗設計及響應面分析對從甜葉菊殘渣中總黃酮的超聲提取工藝進行優(yōu)化；再通過測定1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH的清除率，評價甜葉菊殘渣中總黃酮的抗氧化活性，旨在為甜葉菊殘渣中總黃酮物質的研究開發(fā)利用提供實驗數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甜葉菊殘渣，由日本維科株式會社提供。

DPPH（純度≥95%） 美國Fluka公司；蘆丁標準品（光譜純）、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

UV-3000PC型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；ALC-210.4電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司；HSS-11-6電熱恒溫水浴鍋 上海滬粵明科儀器有限公司；SK5210HP超聲波儀 上?？茖С晝x器有限公司；80-5微電腦離心機 江蘇國華電氣有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵 杭州明遠儀器有限公司；GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3方法

1.3.1甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量的測定

1.3.1.1蘆丁標準曲線的繪制［14］

精確稱取5.00 mg蘆丁標準品，溶于60%乙醇溶液中，充分溶解后轉移到25 mL容量瓶內，定容即得0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。依次吸取蘆丁標準溶液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL置于10 mL容量瓶內，加0.2 mL的5 g/100 mL亞硝酸鈉溶液，混勻，室溫條件下靜置反應6 min，加0.2 mL的1 g/10 mL硝酸鋁溶液，混勻，室溫條件下靜置反應6 min，加2.0 mL的1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，然后用60%乙醇溶液定容，混勻，室溫條件下靜置反應15 min，于波長510 nm處測定吸光度，y（吸光度）為縱坐標，x（總黃酮質量）為橫坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為：y=0.836x+0.007（R2=0.999）。

1.3.1.2總黃酮浸提量的計算［14］

準確稱取5.00 g甜葉菊殘渣樣品，在不同條件下進行總黃酮的提取，抽濾得到提取溶液，用60%乙醇溶液定容到一定體積，精確吸取一定量提取液，根據(jù)1.3.1.1節(jié)方法配制待測液。測定其在510 nm波長處的吸光度，總黃酮浸提量計算見式（1）：

式中：m1為根據(jù)標準曲線計算出提取液中黃酮含量/mg；m2為甜葉菊殘渣質量/g；V1為測定液體積/mL；V2為定容體積/mL。

1.3.2甜葉菊殘渣中總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1單因素試驗設計

甜葉菊殘渣為樣品，以樣品的總黃酮浸提量為考察對象，分別以3 個因素：乙醇體積分數(shù)、超聲時間和超聲功率［15-16］進行單因素試驗，得到各因素對甜葉菊殘渣中總黃銅提取量影響的試驗結果。

1.3.2.2Box-Behnken試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，采用Box-Behnken設計法，選3 個因素：乙醇體積分數(shù)、超聲功率和超聲時間作為自變量，總黃酮浸提量（Y）為響應值，設計試驗的因素和水平，見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素與水平Table1　Factors and their levels used in response surface methodology

1.3.3甜葉菊殘渣中總黃酮抗氧化性的測定

1.3.3.1清除DPPH自由基的測定［17-18］

將上述甜葉菊殘渣提取液進行梯度稀釋，之后依次吸取3 mL上述不同濃度稀釋液于試管內，加入0.04 g/L DPPH溶液3 mL，混勻，避光反應20 min。上述液體在3 500 r/min離心10 min，取上清液，于517 nm波長處測定吸光度Ai；依次吸取3 mL上述不同濃度稀釋液于試管內，依次添加3 mL無水乙醇，搖勻，避光反應20 min。上述液體在3 500 r/min離心10 min，取上清液測定其在517 nm波長處的吸光度Aj；取0.04 g/L DPPH溶液3 mL和無水乙醇3 mL反應作為校準液，在517 nm波長處測定其吸光度A0。DPPH自由基清除率計算見式（2）：

1.3.3.2清除·OH的測定［18］

將上述甜葉菊殘渣提取液進行梯度稀釋，依次吸取2 mL上述稀釋液，依次添加6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL，搖勻后室溫條件下靜置10 min，再添加6 mmol/L水楊酸2 mL，搖勻后室溫條件下靜置30 min，測定其在510 nm波長處的吸光度Ai；同時測定用去離子水替換水楊酸時的吸光度Aj。校準液是用去離子水替換總黃酮溶液，然后測定其吸光度為A0?！H清除率計算見式（2）。

1.4數(shù)據(jù)分析

實驗得到的數(shù)據(jù)均為多次重復實驗得到的平均值，選擇單因素試驗結果較好的水平，采用Design-Expert 8.0軟件進行分析，得到回歸模型及最優(yōu)工藝。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1乙醇體積分數(shù)對總黃酮浸提量的影響

當超聲時間20 min、超聲功率300 W時，分別考察乙醇體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%和80%對甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量的影響，結果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮浸提量的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

圖1顯示，當乙醇體積分數(shù)在30%～70%內，甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量隨乙醇體積分數(shù)的增加呈現(xiàn)增加趨勢；但當乙醇體積分數(shù)高于70%時，總黃酮浸提量呈現(xiàn)下降趨勢；當乙醇體積分數(shù)為70%時，總黃酮浸提量的最大值是5.397 mg/g。因此，后續(xù)試驗選定乙醇體積分數(shù)最優(yōu)值為70%。

2.1.2超聲功率對總黃酮浸提量的影響

當乙醇體積分數(shù)70%、超聲時間20 min時，分別考察超聲功率300、350、400、450、500、550 W對甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量的影響，結果見圖2。

圖2　超聲功率對總黃酮浸提量的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可得，超聲功率從300～400 W時，總黃酮浸提量逐步增大；但當超聲功率超過400 W時，總黃酮浸提量逐漸下降，可能因為過大的超聲功率破壞了黃酮分子，導致總黃酮浸提量的下降［19］；當總黃酮浸提量到達最大（5.647 mg/g）時，超聲功率為400 W。因而，當其他條件保持不變的時候，為了提取出更多黃酮物質，超聲功率選擇400 W。

2.1.3超聲時間對總黃酮浸提量的影響

控制乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率400 W，分別考察超聲時間10、20、30、40、50、60 min時甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量受超聲時間的影響。

圖3　超聲時間對總黃酮浸提量的影響Fig.3　Effect of ultrasonication duration on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，當超聲時間為40 min時，總黃酮浸提量最大可達5.129 mg/g；當超聲時間在40 min內時，隨著超聲時間的延長甜葉菊殘渣中總黃酮的浸提量逐漸增大；隨著超聲時間不斷的延長，總黃酮物質的浸提量呈下降趨勢，由于超聲時間延長，超聲波的作用增強，破壞了黃酮的結構［19］，因此甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量減少。

2.2響應面分析設計及結果

通過Design-Expert 8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析，結果如表3所示。由表3可知，乙醇體積分數(shù)（P＜0.01）、超聲時間（P＜0.01）和超聲功率（P＜0.01）3 個因素均對甜葉菊殘渣總黃酮提取影響顯著［20-21］。以甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量為響應值，經(jīng)回歸擬合，得到的回歸方程為：

表2　響應面試驗設計及結果Table2　Program and experimental results of RSA

表3　方差分析Table3　Analysis of variance for the fltted regression model

方差來源項的P值若小于0.01，則此項為極顯著，在本試驗中，模型A、B、C、A2、B2和C2皆顯著，僅AB、AC、BC三項不顯著，說明模型具有較好的擬合效果；該方程是甜葉菊殘渣中總黃酮浸提量與提取工藝各項參數(shù)的核實數(shù)學模型，因此，該回歸方程可以用來確定甜葉菊殘渣中總黃酮的最優(yōu)提取工藝。離均差平方和的數(shù)值大小反映來源項所引起的響應值變異程度，數(shù)值越小所引起的變異越小，在本試驗中，A、B、C三因素對響應值影響大小依次為B＞C＞A，即超聲功率＞超聲時間＞乙醇體積分數(shù)。

響應面圖形是響應值Y對應于試驗因素A、B和C所構成的三維空間的曲面圖，其在二維平面上的等高線圖可直觀反映各因素及他們之間的交互作用對響應值的影響［22-23］。圖4是根據(jù)回歸方程得到的不同因素的響應面圖和等高線圖。

圖4 兩因素交互作用對總黃酮浸提量的響應面和等高線圖Fig.4　Response surface and corresponding contour plots showing the effects of operating parameters on the extraction rate of total flavonoids

圖4中的立體圖顯示乙醇體積分數(shù)對總黃酮浸提量的影響顯著，曲面彎曲程度大，超聲時間的影響不明顯，曲面彎曲程度?。?4］。在超聲功率和乙醇體積分數(shù)交互作用等高線圖中，等高線沿體積分數(shù)降低方向密集，增高方向稀疏，說明降低乙醇體積分數(shù)會更顯著地影響總黃酮浸提量。同理，降低超聲功率、縮短超聲時間都會更顯著地影響總黃酮浸提量。

對響應面模型進行優(yōu)化分析，得到的最優(yōu)因素組合為乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率420 W、超聲時間42 min，最高總黃酮浸提量的理論值為5.949 mg/g，按此工藝進行實際實驗，得到的總黃酮浸提量為5.928 mg/g，這與理論值基本吻合。

2.3甜葉菊殘渣中總黃酮的抗氧化活性分析

2.3.1甜葉菊殘渣中總黃酮對DPPH自由基清除效果

圖5　VC和甜葉菊殘渣黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.5　DPPH radical scavenging effects of vitamin C and the total flavonoids

VC和甜葉菊殘渣中總黃酮對DPPH自由基清除效果見圖5。甜葉菊殘渣中總黃酮的EC50（即清除率達到50% 時所需藥物的質量濃度）為7.069 μg/mL，而VC的 EC50為5.152 μg/mL，甜葉菊殘渣中總黃酮的EC50約是VC的1.37 倍。表明甜葉菊殘渣中總黃酮有較好的抗氧化活性，雖然不及純度很高的VC，但對DPPH自由基清除率最高可達92.74%。

2.3.2甜葉菊殘渣中總黃酮對·OH清除效果

圖6　VC和甜葉菊殘渣黃酮對·OH的清除作用Fig.6　Hydroxyl radical scavenging effects of vitamin C and the totafll avonoids

目前的研究表明黃酮類化合物能夠抗癌和防癌，且可以有效阻止脂質過氧化破壞細胞［24］。由圖6可知，當甜葉菊殘渣中總黃酮質量濃度是22.065 μg/mL時，50%的·OH得到清除，而VC的EC50是13.74 μg/mL，甜葉菊殘渣中總黃酮的質量濃度是VC質量濃度的1.61 倍。因此，相比于VC，甜葉菊殘渣中總黃酮清除·OH的能力較弱。

3　結 論

通過響應面分析法對各單因素的試驗結果進行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率420 W、超聲時間42 min，按此工藝進行試驗操作，得到的總黃酮浸提量為5.928 mg/g，這與理論值5.949 mg/g相符。表明模型能夠對試驗結果較好的擬合。各因素對總黃酮浸提量影響的顯著性依次為超聲功率、超聲時間和乙醇體積分數(shù)。

通過對甜葉菊殘渣中總黃酮的抗氧化實驗表明，甜葉菊殘渣中總黃酮具有很強的清除DPPH自由基和·OH的能力，其EC50相應為7.096、22.065 μg/mL，分別是VC的1.37、1.61 倍，實驗結果表明甜葉菊殘渣中黃酮類化合物有很好的抗氧化能力。這為甜葉菊殘渣中總黃酮物質的研究開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Total Flavonoids from Stevia rebaudiana Residue: Optimization of Extraction Process by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity Evaluation

C
HEN Ting， XU Wenbin， HONG Yilan， LI Dan， XI Yinci*
（
College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

In this experiment， we optimized the conditions for extracting total flavonoids from stevia （Stevia rebaudiana）residue left after stevioside extraction and determined the antioxidant activity of the total flavonoids. Firstly， we selected ethanol concentration， ultrasound power， and ultrasound treatment time as factors to conduct single factor investigations for the purpose of establishing the appropriate levels for each of these factors. Then， we developed a predictive mathematical model of the yield of total flavonoids using Box-Behnken experimental design for the optimization of extraction conditions by response surface analysis. The optimal extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration， 70%；ultrasound power， 420 W； and ultrasound treatment time， 42 min. Experiments conducted under these conditions gave the maximum yield of total flavonoids of 5.928 mg/g， which was close to the predicted value of 5.949 mg/g. Moreover， antioxidant experiments showed that total flavonoids from stevia residue left after stevioside had very strong scavenging capabilities for DPPH and hydroxyl radicals with EC50values of 7.096 and 22.065 μg/mL， respectively， which were approximately 1.37 and 1.61 times that of vitamin C， respectively. Therefore， the total flavonoids had strong antioxidant capacity.

stevia residue left after stevioside extraction； ultrasonic extraction； total flavonoids； response surface methodology； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201618009

TS201.1

A

1002-6630（2016）18-0052-06

陳婷， 徐文斌， 洪怡藍， 等. 響應面法優(yōu)化甜葉菊殘渣中總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］. 食品科學， 2016， 37（18）: 52-57. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn

CHEN Ting， XU Wenbin， HONG Yilan， et al. Total flavonoids from Stevia rebaudiana residue: optimization of extraction process by response surface methodology and antioxidant activity evaluation［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 52-57. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618009. http://www.spkx.net.cn

2016-01-04

上海海洋大學-日本維科株式會社合作研究基金項目

陳婷（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：chentingjs@163.com

奚印慈（1957—），女，副教授，博士，研究方向為天然物質的生物活性成分。E-mail：xiyinci@gmail.com