薛玲芳，陳雪紅，徐宏偉，韓彥弢*，王春波

(1.青島大學(xué)藥學(xué)院,山東青島 266021；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021)

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狹鱈魚(yú)皮膠原肽對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞氧化損傷作用

薛玲芳1，陳雪紅1，徐宏偉2*，韓彥弢1*，王春波2

(1.青島大學(xué)藥學(xué)院,山東青島 266021；2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266021)

[目的]復(fù)制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞氧化損傷模型，探討?yīng)M鱈魚(yú)皮膠原肽保護(hù)作用機(jī)制。[方法]以人成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為6組：正常對(duì)照組、H2O2損傷組、膠原蛋白肽低(100 μg/mL)、中(300 μg/mL)、高(600 μg/mL)濃度組、陽(yáng)性對(duì)照組(300 μg/mL維生素E)，CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞的存活率，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA的含量，PCR技術(shù)檢測(cè)Foxo3amRNA的表達(dá)水平，Western blot技術(shù)檢測(cè)Sirt1、Foxo3a的蛋白表達(dá)水平。[結(jié)果]與模型組相比，膠原肽組細(xì)胞存活率及SOD的水平升高，MDA含量下降，F(xiàn)oxo3amRNA及蛋白表達(dá)水平下降，Sirt1 蛋白表達(dá)水平上升。[結(jié)論]300 μmol/L H2O2可成功復(fù)制成骨細(xì)胞氧化損傷模型；一定濃度的膠原蛋白肽能降低MDA的含量，提高SOD水平，并具有抗氧化損傷功能，膠原肽對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)作用可能與下調(diào)Foxo3a和上調(diào)Sirt1的表達(dá)水平有關(guān)。

膠原蛋白肽；骨質(zhì)疏松；過(guò)氧化氫；人成骨細(xì)胞；氧化損傷

近年來(lái)，膠原蛋白肽成為國(guó)內(nèi)外廣泛研究的課題之一，狹鱈魚(yú)皮膠原肽是提取自深海狹鱈魚(yú)皮，然后經(jīng)過(guò)多種酶解[1]、滅活等技術(shù)得到的膠原蛋白肽的混合物。研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白肽具有多種生理活性，如抗氧化、抑制血管緊張素酶、降血壓等功效[2-3]。骨質(zhì)疏松是一種與年齡增長(zhǎng)相關(guān)的疾病，多發(fā)于中老年人，尤其是絕經(jīng)后的婦女。骨組織中破骨細(xì)胞所維持的骨吸收與成骨細(xì)胞所維持的骨形成之間的失衡是骨質(zhì)疏松發(fā)生的潛在機(jī)制，體外動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，卵巢切除大鼠體內(nèi)活性氧等自由基的水平上升，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的吸收作用，而抑制成骨細(xì)胞的形成[4]。Foxo(The class O of forkhead box transcription factors)家族因子與氧化應(yīng)激作用有一定的關(guān)系，可保護(hù)細(xì)胞免受損傷，有研究表明，F(xiàn)oxo家族因子通過(guò)上調(diào)抗氧化物酶的活性而維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡[5]。Foxo3a是FOXO家族中的一員，在機(jī)體新陳代謝、細(xì)胞增殖及凋亡等方面起到重要作用。Sirt1是一種存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的NAD+依賴性去乙?；?，隨年齡增長(zhǎng)相關(guān)疾病的發(fā)生與其有密切關(guān)系[6-7]。Sirt1參與成骨細(xì)胞的增殖與分化，并與成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶、骨鈣素等的表達(dá)有關(guān)[8]。因此，根據(jù)膠原肽具有抗氧化的功能特性，該試驗(yàn)采用人體成骨細(xì)胞(Saos-2)作為研究對(duì)象，以過(guò)氧化氫誘導(dǎo)成骨細(xì)胞氧化損傷模型，觀察不同濃度的狹鱈魚(yú)皮膠原肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞存活率，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量以及Sirt1與Foxo3a表達(dá)的影響，研究膠原蛋白肽抗氧化損傷作用機(jī)制，為骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物。狹鱈魚(yú)皮膠原肽粉(青島福生食品有限公司)，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，并用微孔濾膜過(guò)濾，然后稀釋至相應(yīng)濃度。維生素E(Sigma公司)，使用時(shí)用無(wú)水乙醇溶解至相應(yīng)濃度。

1.1.2細(xì)胞株。人成骨細(xì)胞(Saos-2)購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3試劑。H2O2(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司)，α-minimal essential medium(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)AAG205912)；胎牛血清(BI，批號(hào)1544459)； 青鏈霉素混合液、二甲亞砜(批號(hào)20151020，D837),北京索來(lái)寶生物科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(beyotime公司，批號(hào)P0015)；Sirt1抗體(Cell Signaling Technology，貨號(hào)3711S)；Foxo3a抗體(英國(guó)abcam公司，批號(hào)ab154786)；GAPDH抗體(中杉金橋，批號(hào)15900409)；SOD試劑盒、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent(Invitrogen，批號(hào)14104)；FastQuant cDNA第一條鏈合成試劑盒(目錄號(hào)KR106)、2×Taq PCRMasterMix(目錄號(hào)KT201)、6×DNA Loading Buffer(RT201)等，天根生化科技有限公司；Foxo3a、GAPDH引物均由生工生物工程股份有限公司合成，F(xiàn)oxo3a引物序列：上游5’-GTCCGCGATCCTGTACGTGG-3’，下游5’-GTCCTCCTCGGGGATCAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度109 bp。

1.1.4儀器。倒置顯微鏡(江南光學(xué)有限公司，批號(hào)2006254804)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器)；酶標(biāo)儀(FC型Ultiskan)；CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至大約80%時(shí)，加入0.25%的胰蛋白酶溶液，消化并離心，棄上清液，加入含有10%的胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基吹打，分裝至培養(yǎng)瓶中，至于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，備用。

1.2.2細(xì)胞存活率檢測(cè)。試驗(yàn)共分為6組：①正常對(duì)照組、②模型對(duì)照組(300 μmol/L H2O2損傷組)、③膠原肽低濃度組(150 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、④膠原肽中濃度組(300 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、⑤膠原肽高濃度組(600 μg/mL膠原肽+300 μmol/L H2O2)、⑥陽(yáng)性對(duì)照組(300 μg/mL維生素E+300 μmol/L H2O2)。將細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液以后，以每孔104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔體積200 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%時(shí)，③、④、⑤組加入膠原肽預(yù)保護(hù)，⑥組加入維生素E，48 h后，除正常組外，其他各組加入300 μmol/L H2O2。6 h后，吸出舊的培養(yǎng)液，每孔加入含10%CCK-8的細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，培養(yǎng)箱中孵育3 h后，在490 nm的波長(zhǎng)下，用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3SOD、MDA含量測(cè)定。將細(xì)胞以1×104個(gè)/mL鋪于6孔板中，細(xì)胞分組及處理同“1.2.2”，分別取各組細(xì)胞上清液，按試劑盒操作說(shuō)明用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值。

1.2.4PCR檢測(cè)細(xì)胞中Foxo3amRNA的水平。

1.2.4.1細(xì)胞中總RNA的提取。采用Trizol法提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA在260和280 nm下的吸光度值，RNA的濃度為OD260×稀釋倍數(shù)×40 ng/mL，在使用前將濃度調(diào)至1 μg/μL,各組細(xì)胞中mRNA的純度A260/A280均為1.8～2.1。

1.2.4.2反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說(shuō)明，首先配制gDNA去除反應(yīng)體系，再配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，然后將兩者充分混勻，共建立20 μL的反應(yīng)體系，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，獲得cDNA。

1.2.4.3PCR擴(kuò)增。樣品模板6 μL、Primer1(10 μmol/L)0.8 μL、Primer2(10 μmol/L)0.8 μL、2×Taq PCR MasterMix10 μL、ddH2O 2.4 μL，共建立20 μL的反應(yīng)體系，將各組反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀中，并設(shè)置擴(kuò)增程序：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)，72 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4.4瓊脂糖凝膠電泳。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 μL 5×DNA Loading Buffer混合，配制2%的瓊脂糖凝膠，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并在凝膠成像儀中顯影。

1.2.5細(xì)胞中Sirt1、Foxo3a蛋白水平檢測(cè)。

1.2.5.1細(xì)胞總蛋白的提取。待細(xì)胞爬滿至培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并吹打成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度鋪至100 mm大皿中。給藥處理之后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，收集細(xì)胞，每組分別加入含有0.8 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)的細(xì)胞裂解液80 μL，冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。每組各加入5×SDS上樣緩沖液16 mL，95 ℃加熱10 min，冷卻至常溫后，放在-20 ℃冰箱中，冷藏，備用。

1.2.5.2western blot檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參，配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，加樣，電泳分離總蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PAGE膜上50 min，用含5%脫脂奶粉的PBST稀釋一抗(1∶3 000),封閉4 ℃過(guò)夜，PBST洗后，加入二抗(1∶10 000),37 ℃條件下孵育1 h。加顯色液(A液∶B液=1∶1)，顯影，檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響由圖1可見(jiàn)，細(xì)胞用300 μmol/L H2O2損傷后，細(xì)胞存活率為51%，與正常組相比，明顯下降(P<0.05)。在給予濃度分別為150、300、600 μg/mL的膠原蛋白肽預(yù)保護(hù)之后，與模型組相比，細(xì)胞活力升高，且具有劑量依賴性，其中，高濃度組細(xì)胞存活率升高趨勢(shì)明顯(P<0.01)。表明H2O2能夠降低細(xì)胞存活率，而膠原肽能夠保護(hù)細(xì)胞免受損傷。

注：#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。Note: # stands for significant difference compared with normal group(P<0.05);*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.圖1　不同濃度膠原蛋白肽對(duì)細(xì)胞存活率的影響(n=6)Fig.1　Effects of different concentration collagen peptide on cell survival rate

2.2膠原蛋白肽對(duì)H2O2損傷的成骨細(xì)胞中SOD、MDA的影響從表1可看出，與正常組相比，模型組細(xì)胞中SOD含量下降(P<0.01)，MDA含量上升(P<0.05)，與模型組相比，膠原肽預(yù)保護(hù)組SOD含量升高，MDA含量下降(P<0.01)。表明膠原蛋白肽能夠使成骨細(xì)胞中抗氧化酶的含量升高，降低氧化物的含量，因此狹鱈魚(yú)皮膠原肽具有一定的抗氧化功能。

表1不同濃度膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞中SOD、MDA含量的影響(n=6)

Table 1The influence of different concentration of collagen peptide on the concent of SOD and MDA in osteoblast cell

組別GroupsSODU/molMDAnmol/L正常對(duì)照組Normalcontrolgroup93.14±2.801.36±0.04模型對(duì)照組Modelcontrolgroup34.03±4.61##4.05±0.21#膠原肽低濃度組Collagenpep-tidelowconcentrationgroup55.92±4.98*3.62±0.09*膠原肽中濃度組Collagenpep-tidemediumconcentrationgroup66.02±3.91**2.16±0.12**膠原肽高濃度組Collagenpep-tidehighconcentrationgroup84.91±1.39**1.75±0.11**陽(yáng)性對(duì)照組Positivecontrolgroup89.46±1.89**1.55±0.07**

注：#、##分別表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：#,## stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with normal group.*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.

2.3細(xì)胞內(nèi) Foxo3amRNA表達(dá)水平的測(cè)定由圖2～3可見(jiàn)，與正常組相比，H2O2損傷組Foxo3a與GAPDH的灰度值之比升高(P<0.05)；而用不同濃度的膠原肽預(yù)保護(hù)后，隨劑量的增加，F(xiàn)oxo3a與GAPDH的灰度值之比下降(P<0.01)。表明膠原肽能夠降低Foxo3amRNA的表達(dá)水平，且具有劑量依賴性。

注：1.正常對(duì)照組；2.模型對(duì)照組；3.膠原肽低濃度組；4.膠原肽中濃度組；5.膠原肽高濃度組。Note: 1.Normal control group;2.Model control group;3.Collagen petide low dose group;4.Collagen petide middle dose group;5.Collagen petide high dose group.圖2　各組 Foxo3amRNA的相對(duì)表達(dá)量(n=3)Fig.2　Relative expression of Foxo3amRNA in each group(n=3)

注：#表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)；*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。Note: # stands for significant difference compared with normal group(P<0.05);*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.圖3　膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞中Foxo3amRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響(n=3)Fig.3　Effects of collagen peptide on Foxo3amRNA relative expression in osteoblast cell

2.4細(xì)胞內(nèi)Foxo3a、Sirt1蛋白表達(dá)水平測(cè)定從圖4和表2可看出，與正常組相比，H2O2組中Foxo3a與GAPDH灰度值之比上升(P<0.05)，而Sirt1與GAPDH灰度值之比下降(P<0.01)；與模型組相比，給藥組Foxo3a與GAPDH灰度值之比下降，Sirt1與GAPDH灰度值之比上升(P<0.05)。表明300 μmol/L H2O2可以激活Foxo3a蛋白的表達(dá)，抑制Sirt1蛋白的表達(dá)，600 μg/mL膠原蛋白肽可顯著下調(diào)Foxo3a蛋白表達(dá)水平。

注：1.正常對(duì)照組；2.模型對(duì)照組；3.膠原肽低濃度組；4.膠原肽中濃度組；5.膠原肽高濃度組。Note: 1.Normal control group;2.Model control group;3.Collagen petide low dose group;4.Collagen petide middle dose group;5.Collagen petide high dose group.圖4　各組Foxo3a、Sirt1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n=3)Fig.4　Relative expression of Foxo3a,Sirt1 of each group(n=3)

3　討論與結(jié)論

成骨細(xì)胞是由骨髓間質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的，是維持骨的正常發(fā)育和骨組織的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)的重要的功能細(xì)胞。因此，成骨細(xì)胞的研究對(duì)骨相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制及治療途徑有重要意義，如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松等。絕經(jīng)后婦女雌激素水平下降所致的骨質(zhì)疏松尤為常見(jiàn)，主要表現(xiàn)為骨密度的下降，從而增加患者的骨脆性，提高骨折的風(fēng)險(xiǎn)[9]。Guillerminet等[10]分別將來(lái)源于牛、豬組織的膠原蛋白肽作用于鼠的成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞數(shù)量增加，堿性磷酸酶的活性提高。從該研究結(jié)果來(lái)看，將濃度分別為150、300、600 μg/mL的狹鱈魚(yú)皮膠原肽作用于成骨細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖率上升，SOD含量上升，MDA含量下降。表明膠原肽能夠降低成骨細(xì)胞中氧化物的含量，提高抗氧化物的含量。因此，膠原肽可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用，從而在一定程度上保護(hù)成骨細(xì)胞免受H2O2損傷。

表2膠原蛋白肽對(duì)成骨細(xì)胞中Sirt1、Foxo3a相對(duì)表達(dá)量的影響 (n=3)

Table 2The influence of collagen peptide on the relative expression of Foxo3a and Sirt1 in osteoblast cell

組別GroupsFoxo3a/GAPDHSirt1/GAPDH正常對(duì)照組Normalcontrolgroup0.82±0.011.04±0.06模型對(duì)照組Modelcontrolgroup1.07±0.05#0.59±0.01##膠原肽低濃度組Collagenpep-tidelowconcentrationgroup0.98±0.01*0.93±0.01*膠原肽中濃度組Collagenpep-tidemiddleconcentrationgroup0.96±0.02**0.96±0.04**膠原肽高濃度組Collagenpep-tidehighconcentrationgroup0.91±0.03**1.01±0.04**

注：#、##分別表示與正常組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01);*、**分別表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：#,## stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with normal group.*,** stands for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01) compared with model group.

該試驗(yàn)結(jié)果中，與H2O2損傷組相比，膠原肽降低Foxo3amRNA和蛋白表達(dá)水平，提高Sirt1蛋白表達(dá)水平，并具有劑量依賴性。說(shuō)明H2O2能夠激活Foxo3a，而膠原肽能夠抑制H2O2對(duì)Foxo3a的激活。Tseng等[11]研究發(fā)現(xiàn)Sirt1與Foxo3a的C-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)Sirt1/Foxo3a復(fù)合物的形成。因此，狹鱈魚(yú)皮膠原肽抑制H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激可能是通過(guò)上調(diào)Sirt1的表達(dá)水平、下調(diào)Foxo3a的表達(dá)水平導(dǎo)致的。然而，Sirt1/Foxo3a通路是否參與了此過(guò)程，還需要進(jìn)一步的研究。

[1]MUTHUKUMAR T,PRABU P,GHOSH K,et al.Fish scale collagen sponge incorporated with Macrotyloma uniflorum plant extract as a possible woundburn dressing material[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2014,113(1):207-212.

[2]MURAKAMI M,TONOUCHI H,TAKAHASHI R,et al.Structural analysis of a new anti-hypertensive peptide(β-lactosin B)isolated from a commercial whey product[J].Journal of dairy science,2004,87(7):1967-1974.

[3]ZHANG Y,DUAN X,ZHUANG Y.Purification and characterization of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of tilapia (Oreochromis niloticus) skin gelatin[J].Peptides,2012,38(1): 13-21.

[4]LEAN J M,DAVIES J T,FULLER K,et al.A crucial role for thiol antioxidants in estrogen-deficiency bone loss[J].Clin Invest,2003,112(6):915-923.

[5]RACHED M T,KODE A,XU L.FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts[J].Cell Metab,2010,11(2):147-160.

[6]HAIGIS M C,SINCLAR D A.Mammalian Sirtuins: Biological insights and disease relevance[J].Annu Rev Pathol,2010,5:253-295.

[7]BAUR J A,UNGVARI Z,MINOR R K,et al.Are Sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan?[J].Nat Rev Drug Discov,2012,11(6):443-461.

[8]LEE H W,SUH J H,KIM A Y,et al.Histone deacetylase 1-mediated histone modification regulates osteoblast differentiation[J].Mol Endocrinol,2006,20(10):2432-2443.

[9]WEITZMANN M N,PACIFICI R.Estrogen deficiency and bone loss: An inflammatory tale[J].Clin Invest,2006,116(5):1186-1194.

[10]GUILLERMINET F,BEAUPIED H,FABIEN-SOULE V,et al.Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice: an in vitro and in vivo study[J].Bone,2010,46(3):827-834.

[11]TSENG P C,HOU S M,CHEN R J,et al.Rensvertrol promotes osteogensis of human mescenchymal cells by upregulating RUNX2 gene via the SIRT1FOXO3A axis[J].Bone Miner Res,2011,26(10):2552-2563.

Protective Effects of Collagen Peptide from Pollock Skin against H2O2Induced Human Osteoblasts Oxidative Damage

XUE Ling-fang1,CHEN Xue-hong1,XU Hong-wei2*,HAN Yan-tao1*et al

(1.Department of Pharmacology of Qingdao University,Qingdao,Shandong 266021;2.Basic Medical College of Qingdao University,Qingdao,Shandong 266021)

[Objective]The aim was to investigate the protective mechanism of collagen peptide from pollock skin by establishing the H2O2induced human osteoblasts oxygen damaged model.[Method]Human osteoblast cells in logarithmic growth phase were divided into four groups:normal control group,H2O2induced oxygen damaged group,collagen peptide low (100 μg/mL),medium(300 μg/mL) and high(600 μg/mL) does group,positive control group(300 μg/mL VitE).CCK-8 method was performed to determine the survival rate of osteoblasts cells.The content of SOD and MDA were detected by enzymic method.The expression levels of Foxo3 mRNA was determined by PCR,Western Blot was used to detect the protein expression levels of Foxo3 and Sirt1.[Result]Compared with the control group,the survival rate of osteoblasts cells,the level of SOD and the expression of Sirt1 protein in model group was increased,while the content of MDA,the expression of Foxo3a mRNA and Foxo3a protein were declined significantly.[Conclusion]The osteoblasts oxygen damaged model was established induced by 300 μmol/L H2O2.A certain concentration of collagen peptide could reduce the content of MDA and increase the content of SOD against oxygen damage.The mechanism might be related to down-regulating the expression of Foxo3a and up-regulating the expression of Sirt1.

Collagen peptide;Osteoporosis;Hydrogen peroxide;Human osteoblasts;Oxidative damage

青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-3-50-nsh)。

薛玲芳(1989- )，女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：生化藥學(xué)。*通訊作者，徐宏偉，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事生化藥學(xué)研究；韓彥弢，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事海洋藥物與功能食品研究。

2016-07-06

S 986.2

A

0517-6611(2016)25-142-04