康林芝，王 娜，秦 艷，唐惠奇，云 帆

(廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司，廣東廣州 510760)

?

葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件優(yōu)化研究

康林芝，王 娜，秦 艷，唐惠奇，云 帆*

(廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司，廣東廣州 510760)

[目的]優(yōu)化葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件。[方法]以香草蘭為材料，研究葡萄糖苷酶酶解提取香蘭素的工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素與水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定工藝條件的影響因素，以香蘭素含量為響應(yīng)值作響應(yīng)面分析試驗(yàn)。[結(jié)果]葡萄糖苷酶酶解香草蘭的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g，香蘭素含量實(shí)際得率為17.80 mg/g。[結(jié)論]葡萄糖苷酶可水解香蘭素的前體物質(zhì)，釋放出香草蘭中潛在的香氣成分，從而大幅度提高香氣成分含量。

葡萄糖苷酶；香草蘭； 香蘭素； 酶解

香草蘭原產(chǎn)墨西哥，是高級(jí)食用香料，有“食用香料之王”之稱，廣泛用于食品工業(yè)、煙、酒和高級(jí)化妝品[1-2]。香蘭素是香草蘭豆莢中最主要的生香物質(zhì)，但剛成熟的香草蘭豆莢并不具有特征香氣，其豆莢經(jīng)過(guò)生香加工后才具有濃郁的香味[3]。香草蘭豆莢加工過(guò)程中生香的原因主要是因?yàn)槎骨v中的β-葡萄糖苷酶會(huì)催化香蘭素葡萄糖苷分解形成香蘭素和葡萄糖，生成的香蘭素賦予香草蘭香味。江明等[4]研究了香草蘭果莢內(nèi)源β-葡萄糖苷酶在不同加工條件下的活性變化，結(jié)果表明，香草蘭在經(jīng)過(guò)殺青及干燥處理后，β-葡萄糖苷酶的活性有所升高。但是香草蘭自身含有的葡萄糖苷酶非常有限，導(dǎo)致香草蘭的傳統(tǒng)生香周期長(zhǎng)達(dá)1年，耗費(fèi)大量的人力物力[5]。Ranadive[6]及浦帆等[7]在成熟香草蘭果莢中添加外源β-葡萄糖苷酶，研究發(fā)現(xiàn)豆莢中的香蘭素含量明顯提高，證明β-葡萄糖苷酶在香草蘭的生香過(guò)程中起著重要的作用，同時(shí)也證明了酶促生香的可行性。筆者采用響應(yīng)面優(yōu)化了利用葡萄糖苷酶酶解香草蘭原料的工藝條件，為工業(yè)化高效生產(chǎn)純天然香蘭素奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料香草蘭，產(chǎn)地海南，海南興科興隆熱帶植物園開(kāi)發(fā)有限公司。β- 葡萄糖苷酶：酶活力5.5 U/mg，上海Sigma試劑公司。標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物香蘭素，分析純，購(gòu)買(mǎi)于上海生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1香草蘭中香氣成分的提取方法。香草蘭豆莢低溫干燥、粉碎，取20 g粉末置于500 mL三角燒瓶中，然后在粉碎豆莢中加入20單位的葡萄糖苷酶，置于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)18 h，之后進(jìn)行熟化。取酶解后的樣品用95%的乙醇索式抽提16 h，提取物定容至100 mL，然后進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定。

1.2.2香蘭素含量的定量分析方法。利用紫外分光光度法分析酶促生香樣品中香蘭素的含量[8]。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取0.01 g香蘭素于10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解后定容至刻度，備用。其濃度為1.0 mg/mL。

1.2.2.2試樣液的制備。準(zhǔn)確稱取試樣約0.01 g，制備方法與上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備相同。取上述各溶液分別放入1 cm石英池中，在最大吸收波長(zhǎng)約308 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算香蘭素含量。

1.2.3香草蘭的酶促生香研究[9]。根據(jù)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可知，香草蘭酶促生香過(guò)程中各項(xiàng)影響酶促反應(yīng)的參數(shù)均將影響酶促反應(yīng)的速度與強(qiáng)度，從而影響香草蘭酶促生香的加工時(shí)間長(zhǎng)短以及產(chǎn)品中香蘭素含量。酶促生香加工以產(chǎn)品中香蘭素含量為指標(biāo)，對(duì)提取物進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定分析。由于反應(yīng)溫度、時(shí)間、 體系 pH等工藝參數(shù)是影響酶促反應(yīng)的主要因素。因此，該試驗(yàn)從加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比等方面研究β-葡萄糖苷酶的酶解作用對(duì)香草蘭中香蘭素含量的影響，并以傳統(tǒng)生香方法生香的香草蘭豆莢提取物作為對(duì)照。

1.2.3.1不同反應(yīng)溫度對(duì)香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進(jìn)行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35、40、45、50、55 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進(jìn)行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對(duì)香蘭素進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測(cè)定分析。

1.2.3.2不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進(jìn)行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解4、12、18、24、32 h后進(jìn)行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對(duì)香蘭素進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測(cè)定分析。

1.2.3.3不同料液比對(duì)香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200、300、400、500、600、700 mL(料液比依次為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)進(jìn)行勻漿。在勻漿液中加入20 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進(jìn)行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對(duì)香蘭素進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測(cè)定分析。

1.2.3.4不同加酶量對(duì)香草蘭酶促生香研究的影響。取殺青后的香草蘭豆莢50 g切碎至均勻大小，加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖液200 mL進(jìn)行勻漿。在勻漿液中加入15、20、25、30、35 U/g的β-葡萄糖苷酶，在35 ℃的酶解溫度下，攪拌酶解18 h后進(jìn)行熟化。熟化完全的香草蘭豆莢利用“1.2.1”方法提取，對(duì)香蘭素進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測(cè)定分析。

1.2.4β-葡萄糖苷酶酶解香草蘭的工藝條件優(yōu)化。通過(guò)對(duì)加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比等方面進(jìn)行了單因素試驗(yàn)考察，采用響應(yīng)面法在3因子3水平上對(duì)β-葡萄糖苷酶酶解香草蘭工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。選取酶解溫度、料液比和加酶量作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析因子，同樣條件下制備一個(gè)不加酶的空白對(duì)照樣，之后進(jìn)行熟化，熟化完全的香草蘭豆莢以產(chǎn)品中香蘭素含量為指標(biāo)對(duì)提取物進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同單因素對(duì)香蘭素含量的影響

2.1.1不同反應(yīng)溫度對(duì)香蘭素含量的影響。在酶解溫度不同的條件下提取香蘭素，其他條件(料液比1∶12 g/mL，反應(yīng)時(shí)間18 h，加酶量為20 U/g)相同，計(jì)算不同酶解溫度條件下香蘭素含量。

對(duì)50 g香草蘭豆莢進(jìn)行酶解溫度的單因素試驗(yàn)，分別測(cè)定各處理組中的香蘭素含量。由圖1可以看出，酶解溫度處于50 ℃時(shí)，提取的香蘭素相對(duì)含量達(dá)到最大值。在50 ℃之前，隨著溫度的升高，酶的水解效果不斷提高；但在50 ℃以后，香蘭素含量開(kāi)始下降。因此，該試驗(yàn)采用50 ℃的酶解溫度。

圖1　酶解溫度對(duì)香蘭素含量的影響Fig.1　Effects of enzymolysis temperature on the vanillin content

2.1.2不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響。在酶解時(shí)間不同的條件下提取香蘭素，其他條件(料液比1∶12 g/mL，反應(yīng)溫度45 ℃，加酶量為20 U/g)相同，計(jì)算不同酶解時(shí)間條件下香蘭素含量。

對(duì)50 g香草蘭豆莢進(jìn)行酶解時(shí)間的單因素試驗(yàn)，分別測(cè)定各處理組中的香蘭素含量。由圖2可以看出，隨著酶解時(shí)間的不斷增加，香蘭素含量逐步增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)，提取的香蘭素相對(duì)含量達(dá)到最大值。但在24 h之后，香蘭素含量又隨著酶解時(shí)間的增加而降低，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，一些香氣成分揮發(fā)造成測(cè)到的香蘭素有所降低。因此，該試驗(yàn)采用24 h為最佳酶解時(shí)間。

圖2　酶解時(shí)間對(duì)香蘭素含量的影響Fig.2　Effects of enzymolysis time on the vanillin content

2.1.3不同料液比對(duì)香蘭素含量的影響。在料液比不同的條件下提取香蘭素，其他條件(反應(yīng)時(shí)間18 h，反應(yīng)溫度45 ℃，加酶量為20 U/g)相同，計(jì)算不同料液比條件下香蘭素含量。

對(duì)50 g香草蘭豆莢進(jìn)行料液比的單因素試驗(yàn)，分別測(cè)定各處理組中的香蘭素含量。由圖3可以看出，隨著料液比中溶劑用量的提高，香蘭素含量逐步增加，當(dāng)料液比為1∶12 g/mL時(shí)，提取的香蘭素相對(duì)含量達(dá)到最大值；料液比中溶劑用量繼續(xù)增加時(shí)，香蘭素含量沒(méi)有隨之增加。因此，該試驗(yàn)采用1∶12 g/mL為最佳料液比。

圖3　料液比對(duì)香蘭素含量的影響Fig.3　Effects of solid-liquid ratio on the vanillin content

2.1.4不同加酶量對(duì)香蘭素含量的影響。在加酶量不同的條件下提取香蘭素，其他條件(反應(yīng)時(shí)間18 h，反應(yīng)溫度45 ℃，料液比1∶12 g/mL)相同，計(jì)算不同加酶量條件下香蘭素含量。

對(duì)50 g香草蘭豆莢進(jìn)行加酶量的單因素試驗(yàn)，分別測(cè)定各處理組中的香蘭素含量。由圖4可以看出，隨著加酶量的增加，香蘭素含量逐步增加，當(dāng)加酶量為20 U/g時(shí)，提取的香蘭素相對(duì)含量達(dá)到最大值；加酶量繼續(xù)增加時(shí)，香蘭素含量沒(méi)有明顯增加。因此，該試驗(yàn)采用20 U/g為最佳加酶量。

圖4　加酶量對(duì)香蘭素含量的影響Fig.4　Effects of enzyme volume on the vanillin content

2.2提取香蘭素工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)響應(yīng)面分析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化工、生物技術(shù)等方面，其目的是在現(xiàn)有的試驗(yàn)基礎(chǔ)上尋找到試驗(yàn)范圍上的因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，以確定最佳提取工藝參數(shù)[13]。

2.2.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)對(duì)不同反應(yīng)溫度、不同反應(yīng)時(shí)間、不同料液比、加酶量進(jìn)行綜合考慮，采用3因素3水平，根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)香蘭素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，設(shè)計(jì)方案所得的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1響應(yīng)面3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 1Three factors and three levels test design of response surface analysis

2.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)學(xué)模型的建立。按照Design Expert 軟件中的Box-Behnken Design 模型對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到香蘭素含量對(duì)反應(yīng)溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=17.29-0.15A+0.3B+0.95C-0.53AB+0.076AC+0.4BC-1.78A2+0.36B2-2.33C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果得出：FA=0.32，PA=0.586 4；FB=1.28，PB=0.284 1；FC=12.91，PC=0.004 9；FA2=12.54，PA2=0.005 3；FB2=0.52，PB2=0.487 6；FC2=21.50，PC2=0.000 9；FAB=3.26，PAB=0.101 3；FAC=0.067，PAC=0.800 9；FBC=1.88，PBC=0.200 2；F模型=11.73，P模型=0.000 3**；F失擬=4.04，P失擬=0.075 8。由此可以看出，模型顯著性水平P<0.01，表明二次方程模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.075 8>0.05，即模型差異不顯著，說(shuō)明模型殘差均由隨機(jī)誤差引起。

表2　Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及其響應(yīng)值

綜合以上所述，說(shuō)明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。因此，該模型可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可利用模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)制備香蘭素的工藝結(jié)果。

2.2.3響應(yīng)面優(yōu)化與分析。利用Design Expert 7.1.6軟件，繪制各影響因素對(duì)香蘭素的響應(yīng)曲面圖，分析酶解溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)對(duì)香蘭素含量的影響。響應(yīng)曲面的坡度平緩說(shuō)明隨著處理?xiàng)l件的變化，響應(yīng)值的大小不受影響，但是，當(dāng)曲面坡度陡峭時(shí)，則說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)處理?xiàng)l件的改變非常敏感。

比較圖5、6、7可知，酶解溫度(A)、料液比(B)、加酶量(C)對(duì)香蘭素含量的影響極為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，其中加酶量對(duì)香蘭素含量的影響最大。

圖5　料液比與反應(yīng)溫度對(duì)香蘭素含量的影響Fig.5　Effects solid-liquid ratio and reaction temperature on the vanillin content

圖6　加酶量與反應(yīng)溫度對(duì)香蘭素含量的影響Fig.6　Effects enzyme volume and reaction temperature on the vanillin content

圖7　加酶量與料液比對(duì)香蘭素含量的影響Fig.7　Effects enzyme volume and solid-liquid ratio on the vanillin content

2.2.4優(yōu)化與驗(yàn)證。由 SAS分析得到香蘭素提取的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度 43.81 ℃，料液比1∶13.82 g/mL，加酶量16.3 U/g，此時(shí)的理論得率達(dá)到了18.188 1 mg/g。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行香蘭素提取的驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作的便利性，以反應(yīng)溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g為最佳。3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際平均得率為17.80 mg/g，與理論值相差 0.02%。因此，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得到葡萄糖苷酶酶解香草蘭豆莢提取工藝條件是可行的，具有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。

3　結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了葡萄糖苷酶對(duì)香草蘭進(jìn)行酶解的工藝，葡萄糖苷酶酶解香草蘭的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度 44 ℃，料液比1∶14 g/mL，加酶量16 U/g，此條件下香蘭素含量實(shí)際得率17.80 mg/g。結(jié)果表明，經(jīng)葡萄糖苷酶處理后得到的香草蘭提取物，其中的香蘭素含量明顯提高，其香氣也更加濃郁，說(shuō)明葡萄糖苷酶可以將香蘭素前體物質(zhì)香蘭素葡萄糖苷分解形成香蘭素和葡萄糖，生成的香蘭素賦予香草蘭香味。

[1]WALTON N J，MAYER M J，NARBAD A.Molecules of interestvanillin[J].Phytochemistry，2003，63(5)：505-515.

[2]WALISZEWSKI K N，PARDIO V T，OVANDO S L.A simple and rapid HPLC technique for vanillin determination in alcohol extract[J].Food chemistry，2007，101(3)：1059-1062.

[3]韓秀山.我國(guó)香蘭素發(fā)展概況[J].四川化工與腐蝕控制，2002，5(1)：36-37.

[4]江明，劉濤，楊祖武，等.不同加工處理?xiàng)l件下香莢蘭莢果中二種內(nèi)源酶的活性變化[J].云南植物研究，2005，27(3)：310-314.

[5]宋剛，曹勁松，彭志英.香蘭素的生物合成[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(7)：72-74.

[6]RANADIVE A S.Vanillin and related flavour compounds in vanilla extractsmade frombeans of various global origins[J].Journal of agricultural and food chemistry，1992，40(10)：1922-1924.

[7]浦帆，江明，張正居，等.香莢蘭酶促生香的研究[J].云南植物研究，1998，20(3)：355-361.

[8]韋壽蓮，趙建芬.紫外分光光度法測(cè)定食品中香蘭素的含量[J].肇慶學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(5)：31-33.

[9]孫海彥，王茜，彭明.利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化香蘭素葡萄糖苷水解[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30(6)：687-690.

Optimization of the Technology Condition of Vanilla Enzyme Digestion by Glycosidase

KANG Lin-zhi,WANG Na,QIN Yan,YUN Fan*et al

(Guangzhou Alchemy Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510760)

[Objective]To optimize the technology condition of vanilla enzyme digestion by glycosidase.[Method]With vanilla as the material,we researched the extraction technology of vanillin by glycosidase enzymolysis.Test factor and level were selected based on single factor test.Response Surface Analysis was designed based on three factors and three levels.According to the regression analysis,influencing factor of technology condition was determined.With vanillin content as the response value,response surface analysis was carried out.[Result]The optimal technology condition of vanilla enzyme digestion by glycosidase was as follows: 44 ℃ reaction temperature,1∶14 g/mL solid-liquid ratio,and 16 U/g enzyme volume.Under this condition,the extraction rate of vanillin content was 17.80 mg/g.[Conclusion]Glycosidase can hydrolyse the precursor of vanillin,release the potential components of vanilla aroma,and greatly improve the aroma composition.

Glycosidase enzyme;Vanilla;Vanillin;Enzymolysis

康林芝(1988- )，女，山東菏澤人，工程師，博士，從事食品生物技術(shù)研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事食品生物技術(shù)研究。

2016-06-29

S 573

A

0517-6611(2016)25-058-04