史會娟，高 靜，石冬璇，李 晶

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·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

啟膈散對食管癌細胞間同質(zhì)黏附力的影響

史會娟，高 靜，石冬璇，李 晶

背景食管癌的發(fā)病率有明顯的地理特征，每年約有50%的新診斷病例發(fā)生在中國。目的研究啟膈散對食管癌細胞間同質(zhì)黏附力的影響，并探討其作用機制。方法2015年3—6月，體外培養(yǎng)Eca109、TE13、TE1，采用機械法檢測不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)干預后Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值，Western blotting法檢測不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)干預后Eca109、TE13、TE1中Cx32表達水平，免疫細胞化學法檢測不同劑量啟膈散(0 μg/ml和100 μg/ml)(分別為對照組、啟膈散組)干預后Eca109、TE13、TE1中E-cadherin表達情況，劃痕實驗檢測不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)干預后Eca109、TE13、TE1遷移能力。結(jié)果低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于對照組(P<0.05)；高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于低劑量組(P<0.05)。低劑量組TE1中Cx32表達水平高于對照組(P<0.05)；高劑量組Eca109、TE13、TE1中Cx32表達水平高于對照組、低劑量組(P<0.05)。對照組、啟膈散組Eca109、TE1、TE13中E-cadherin表達均為陰性，未見表達增強。低劑量組、高劑量組12 h、24 h時Eca109、TE13、TE1劃痕寬度大于對照組(P<0.05)；高劑量組12 h時Eca109劃痕寬度大于低劑量組，12 h、24 h時TE13、TE1劃痕寬度大于低劑量組(P<0.05)。結(jié)論啟膈散能夠增加Cx32表達水平，從而提高食管癌細胞間同質(zhì)黏附力，進而抑制食管癌細胞的遷移。

食管腫瘤；細胞黏附；細胞運動；啟膈散

史會娟，高靜，石冬璇，等.啟膈散對食管癌細胞間同質(zhì)黏附力的影響[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(27)：3317-3321.[www.chinagp.net]

SHI H J,GAO J,SHI D X,et al.Effect of Qigesan on the cell-cell adhesion of esophageal cancer[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3317-3321.

食管癌發(fā)病有明顯的地域性差別，我國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家，河南林州、河北磁縣及涉縣、山西陽城是食管癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率達到世界平均水平的10倍[1]。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學特征，是最終導致食管癌患者死亡的主要原因[2]。作為食管癌高發(fā)區(qū)，尋求抑制其轉(zhuǎn)移的有效方法十分重要。

啟膈散出自程國彭(清)的《醫(yī)學心悟》[3]，其認為前人以大小半夏湯等燥烈止吐之品治療噎膈，實屬醫(yī)家之誤，不應(yīng)盲從，提出“凡噎膈癥，不出胃脘干槁四字”，應(yīng)用啟膈散甘潤濡養(yǎng)以治噎膈。啟膈散為“甘潤濡養(yǎng)”的代表方，能夠針對食管癌“胃脘干槁”的病理機制進行治療，進而抑制食管癌細胞轉(zhuǎn)移[4]，但其具體機制仍不明確。本研究旨在探討啟膈散對食管癌細胞間同質(zhì)黏附力的影響，并探討其作用機制，以期為啟膈散治療食管癌提供免疫學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料人食管癌細胞株Eca109、TE13、TE1由河北省腫瘤研究所提供，購自中國科學院上海細胞生物學研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司；胎牛血清購自美國Biological公司；兔抗人E-cadherin、Cx32抗體購自美國Bioworld Technology,Inc.公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)2015年3—6月，低分化人食管癌細胞株TE13及高分化人食管癌細胞株Eca109、TE1均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待細胞貼壁生長至融合度達90%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2啟膈散提取物制備將郁金75 g、沙參75 g、丹參50 g、浮小麥15 g、浙貝30 g、茯苓30 g、砂仁30 g、荷葉15 g采用水提法制備提取物，分裝并儲存于-80 ℃冰箱，用完全培養(yǎng)基配置1 mg/ml儲存液，并用濾器過濾，保存于無菌離心管中，用封口膜封口，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3機械法檢測細胞同質(zhì)黏附值[5]采用機械法測定細胞同質(zhì)黏附值，96孔板中分別加入Eca109、TE13、TE1(105個/ml)，每孔100 μl，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞鋪至70%～80%時，加不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)培養(yǎng)24 h。當細胞單層長滿96孔板底層，每孔加入105個/ml的同種細胞100 μl，每組設(shè)6個復孔。將細胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中分別孵育60 min后吸出未結(jié)合的細胞懸液。在光鏡下計數(shù)，加入細胞數(shù)和吸出細胞數(shù)之差為細胞同質(zhì)黏附值，取其均值。實驗重復3次。

本研究背景：

河北是食管癌的高發(fā)地區(qū)，本研究組能夠接觸到大量食管癌患者，通過長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，多數(shù)食管癌患者存在口干、便秘、消瘦、舌質(zhì)紅、脈細等陰虛癥候，即使食管癌術(shù)后的患者，這種陰虛體質(zhì)仍然沒有改善，而應(yīng)用啟膈散治療食管癌患者能夠明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，可能延長患者生存期。《醫(yī)學心悟》中也指出“凡噎膈癥，不出胃脘干槁四字”，應(yīng)用啟膈散“甘潤濡養(yǎng)”以治噎膈。結(jié)合臨床所見患者癥候，筆者認為，啟膈散為“甘潤濡養(yǎng)”的代表方，能夠針對食管癌“胃脘干槁”的病理機制進行干預治療，從而抑制食管癌的轉(zhuǎn)移。

1.2.4Western blotting法檢測Cx32表達水平[6]收集不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)培養(yǎng)24 h的Eca109、TE13、TE1，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次后，刮下細胞，4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min(離心半徑6 cm)，棄上清液，加入全細胞裂解液100 μl，放置冰上30 min。4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min(離心半徑6 cm)，取上清液即為細胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的操作步驟進行蛋白定量檢測。將Cx32與5×上樣緩沖液混合均勻，100 ℃水浴加熱5 min使蛋白變性，冷卻后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(兔抗人Cx32抗體)結(jié)合過夜，洗膜，二抗(Donkey Anti-Rabbit IgG H&L preadsorbed)結(jié)合。TBST室溫洗膜3次，10 min/次，采用成像分析軟件對Western blotting法顯色區(qū)帶的信號強度進行相對定量分析，掃描結(jié)果用灰度值表示。實驗重復3次。

1.2.5免疫細胞化學法檢測E-cadherin表達情況收集不同劑量啟膈散(0 μg/ml和100 μg/ml)(分別為對照組、啟膈散組)培養(yǎng)24 h的Eca109、TE1、TE13，爬片，多聚甲醛固定，3%甲醇過氧化氫中室溫孵育20～25 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗3次，3 min/次，在0.01 mol/L PBS中浸泡5 min；山羊血清封閉，37 ℃濕盒內(nèi)孵育細胞45 min；傾去血清，滴加1∶200稀釋的兔抗人E-cadherin一抗，4 ℃過夜，0.01 mol/L PBS沖洗3次，5 min/次；二抗(羊抗兔IgG抗體)37 ℃濕盒內(nèi)孵育細胞30 min，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3 次，5 min/次；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃濕盒內(nèi)孵育細胞30 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，5 min/次；DAB液顯色，蒸餾水終止顯色；蘇木素復染1 min，自來水沖洗3次，鹽酸溶液和乙醇溶液沖洗1次，自來水沖洗1次，氨水返藍1 min，自來水沖洗1次，80%乙醇溶液浸泡5 min，95%乙醇溶液浸泡5 min，無水乙醇浸泡2次，5 min/次，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。結(jié)果由病理科主任醫(yī)師獨立閱片。判定標準：參照文獻[7]中的方法，每張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞。按染色強度和染色陽性細胞百分率綜合評分：無染色為0分，染色較弱為1分，中等強度為2分，強染色為3分；染色陽性細胞百分率<6%為0分，6%～<26%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。每張切片平均染色強度得分與染色陽性細胞百分率得分相乘，結(jié)果≤1分為陰性(-)，2～3分為陽性(+)，4～6分為弱陽性(++)，>6分為強陽性(+++)。實驗重復3次。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞遷移能力參照ZHANG等[8]的方法，將Eca109、TE13、TE1以5×106/ml密度接種于12孔板培養(yǎng)24 h，并給予不同劑量啟膈散(0、50、100 μg/ml)(分別為對照組、低劑量組、高劑量組)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞達90%匯合時，用100 μl無菌槍頭劃痕，PBS清洗3次，去除劃痕處劃下的懸浮細胞，放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0、12、24 h拍照，顯微鏡下測量劃痕的寬度，以0 h時劃痕寬度為標準對照。實驗重復3次。劃痕寬度越大，表明細胞遷移能力越弱。

2　結(jié)果

2.1同質(zhì)黏附值比較對照組、低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1Comparison of cell-cell adhesion of Eca109,TE13 and TE1 among control group,low dose group and high dose group

組別Eca109TE13TE1對照組1046±21 913±29 876±40低劑量組1140±49b1067±65b1021±39a高劑量組1220±45ab1203±32ab1178±84abF值13.99231.05320.403P值0.0060.0010.002

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05

2.2Cx32表達水平比較對照組、低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1中Cx32表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中，低劑量組TE1中Cx32表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組Eca109、TE13、TE1中Cx32表達水平高于對照組、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1、表2)。

圖1　Western blotting法檢測Cx32表達水平的SDS-PAGE圖

Figure 1SDS-PAGE of measurement of Cx32 expression level by Western blotting method

Table 2Comparison of expression level of Cx32 in Eca109,TE13 and TE1 among control group,low dose group and high dose group

組別Eca109TE13TE1對照組0.11±0.020.10±0.010.07±0.02低劑量組0.13±0.020.12±0.020.10±0.01a高劑量組0.23±0.01ab0.19±0.02ab0.18±0.01abF值40.75029.08764.000P值<0.0010.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05

2.3E-cadherin表達情況比較對照組、啟膈散組Eca109、TE1、TE13中E-cadherin表達均為陰性，未見表達增強(見圖2，本文圖2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.4劃痕寬度比較對照組、低劑量組、高劑量組12 h、24 h時Eca109、TE13、TE1劃痕寬度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組、高劑量組12 h、24 h時Eca109、TE13、TE1劃痕寬度大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組12 h時Eca109劃痕寬度大于低劑量組，12 h、24 h時TE13、TE1劃痕寬度大于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3、表3)。

表3　對照組、低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1劃痕寬度比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05

圖3　劃痕實驗檢測細胞遷移能力

圖2　免疫組化法檢測Eca109、TE13、TE1中E-cadherin表達情況

Figure 2Measurement of E-cadherin expression in Eca109,TE13 and TE1 by immunocytochemistry

3　討論

轉(zhuǎn)移是個多因素、多環(huán)節(jié)的復雜病理過程。在腫瘤轉(zhuǎn)移的各個環(huán)節(jié)中均涉及細胞黏附作用[9]。腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，與同質(zhì)黏附力減弱有關(guān)，是發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步。有實驗證實，腫瘤細胞間同質(zhì)黏附值比正常細胞低，有利于腫瘤細胞離開原發(fā)灶[10]，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，增強腫瘤細胞間同質(zhì)黏附力將有可能防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。啟膈散是針對食管癌的古方，其能否增強食管癌細胞間同質(zhì)黏附力，目前仍未見相關(guān)報道。本研究從同質(zhì)黏附力著眼，研究啟膈散對食管癌細胞的作用，以期為啟膈散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，低劑量組、高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于對照組，高劑量組Eca109、TE13、TE1同質(zhì)黏附值大于低劑量組，提示啟膈散能夠增強食管癌細胞間同質(zhì)黏附力，且100 μg/ml啟膈散作用更明顯。E-cadherin作為被研究得最為透徹的細胞黏附分子，對維持正常上皮細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性起重要作用，其主要介導細胞間同質(zhì)黏附力從而使細胞密切接觸[11]。因此，本研究進一步檢測了人食管癌細胞Eca109、TE13、TE1的粘連蛋白E-cadherin和間隙連接蛋白Cx32的水平。

細胞間隙連接(GJ)是細胞間直接進行信息交換的重要通道，癌變過程中多伴隨GJ功能的減弱[12]。連接蛋白是GJ的物質(zhì)基礎(chǔ)，腫瘤細胞中均存在間隙連接蛋白Cx32的表達降低，Cx32基因被認為是一類腫瘤抑制基因[6]。有研究證實，食管癌細胞轉(zhuǎn)移常伴有Cx32的異常定位和表達[13]。本研究結(jié)果顯示，高劑量組Eca109、TE13、TE1中Cx32表達水平高于對照組、低劑量組，提示啟膈散能夠增強食管癌細胞Cx32的表達。

E-cadherin是黏附素家族的主要成員，是維持細胞間同質(zhì)黏附力的主要因素之一，且其通過介導Ca2+依賴性間隙連接形成途徑從而促進間隙連接蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)其磷酸化[14]。本研究結(jié)果顯示，對照組、啟膈散組Eca109、TE1、TE13中E-cadherin表達均為陰性，未見表達增強。證實啟膈散增強細胞間同質(zhì)黏附力并不是通過增強E-cadherin的表達來實現(xiàn)的。

有研究證實，同質(zhì)黏附力的增強能夠抑制腫瘤細胞的運動能力[10]，所以本研究繼續(xù)進行了劃痕試驗觀察啟膈散對食管癌細胞遷移能力的影響，進一步驗證細胞間同質(zhì)黏附力的變化，結(jié)果顯示，低劑量組、高劑量組12 h、24 h時Eca109、TE13、TE1劃痕寬度大于對照組，高劑量組12 h時Eca109劃痕寬度大于低劑量組，12 h、24 h時TE13、TE1劃痕寬度大于低劑量組，提示低劑量組、高劑量組細胞遷移能力弱于對照組，高劑量組細胞遷移能力弱于低劑量組，說明啟膈散能夠增強細胞間同質(zhì)黏附力，從而抑制食管癌細胞的遷移，且100 μg/ml啟膈散作用更明顯。

本研究為體外細胞研究階段，所有實驗結(jié)果有待體內(nèi)試驗的進一步證實。而且有大量研究顯示，間隙連接與腫瘤細胞間的同質(zhì)黏附力、細胞骨架、上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化均有密切聯(lián)系[15]。因此，今后將從腫瘤細胞間同質(zhì)黏附力和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面進一步揭示啟膈散抑制食管癌轉(zhuǎn)移的機制，并指導臨床治療應(yīng)用。

綜上所述，啟膈散能夠增加Cx32表達水平，從而增強食管癌細胞間同質(zhì)黏附力，進而抑制食管癌細胞的遷移。

作者貢獻：史會娟進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；高靜進行實驗實施、評估、資料收集；石冬璇負責資料收集整理、實驗實施、數(shù)據(jù)統(tǒng)計；李晶進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Qigesan on the Cell-cell Adhesion of Esophageal Cancer

SHIHui-juan,GAOJing,SHIDong-xuan,LIJing.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,ChinaCorrespondingauthor:LIJing,DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China;E-mail:lijingtiger@163.com

BackgroundThe incidence of esophageal cancer has distinct geographical characteristics,with approximately 50% of all newly diagnosed cases occurring in China annually.ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of Qigesan on the cell-cell adhesion of esophageal carcinoma.MethodsFrom March to June in 2015,the human esophageal carcinoma cell lines Eca109,TE13 and TE1 were cultured in vitro.Eca109,TE13 and TE1 were treated with the different dose of Qigesan (0 μg/ml in control group,50 μg/ml in low dose group,100 μg/ml in high dose group),the cell-cell adhesion was tested by mechanical method,the expression level of Cx32 in Eca109,TE13 and TE1 was detected by Western blotting method.The expression of E-cadherin in Eca109,TE13 and TE1 with different dose of Qigesan (0 μg/ml in control group,100 μg/ml in Qigesan group) was detected by SP immunohistochemistry method.The metastatic abilities of Eca109,TE13 and TE1 with different dose of Qigesan (0 μg/ml in control group,50 μg/ml in low dose group,100 μg/ml in high dose group) were detected by scratch-wound assays.ResultsThe cell-cell adhesion of Eca109,TE13 and TE1 in low dose group and high dose group was higher than that in control group respectively (P<0.05);the cell-cell adhesion of Eca109,TE13 and TE1 in high dose group was higher than that in low dose group (P<0.05).The expression level of Cx32 of TE1 in low dose group was higher than that in control group (P<0.05);the expression level of Cx32 of Eca109,TE13 and TE1 in high dose group was higher than that in control group and low dose group respectively (P<0.05).The expression of the E-cadherin was negative in control group and Qigesan group.At 12 h and 24 h,the scratch of Eca109,TE13 and TE1 in low dose group and high dose group was wider than that in control group respectively (P<0.05).At 12 h,the scratch of Eca109 in high dose group was wider than that in low dose group (P<0.05).At 12 h and 24 h,the scratch of TE13 and TE1 in high dose group was wider than that in low dose group (P<0.05).ConclusionQigesan can improve the expression level of Cx32,then improve the cell-cell adhesive ability and reduce the migratory ability of esophageal carcinoma cells.

Esophageal neoplasms;Cell adhesion;Cell movement;Qigesan

國家自然科學基金資助項目(81403310)；河北省科技廳資助項目(13277718D)

050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院中醫(yī)科(史會娟，高靜，李晶)；河北醫(yī)科大學研究生學院(石冬璇)

李晶，050011 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院中醫(yī)科；E-mail：lijingtiger@163.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.012

2016-01-03；

2016-06-27)