陳昕明，劉曉亮，吳 偉

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·論著·

c-junN端蛋白激酶1磷酸化與糖尿病大鼠早期心肌損傷關(guān)系研究

陳昕明，劉曉亮，吳 偉

目的探討c-junN端蛋白激酶1(JNK1)磷酸化與糖尿病(DM)大鼠早期心肌損傷的關(guān)系。方法2013年10月—2014年7月，80只SPF級雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取60只作為DM模型組，給予高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周，一次性左下腹腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液(35 mg/kg)；另外20只作為對照組(A組)，給予普通飲食飼養(yǎng)4周，一次性左下腹腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。最終共48只大鼠造模成功，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為B組、C組、D組，各16只。C組大鼠腹腔注射SP600125，D組大鼠皮下埋置含有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)+0.9%氯化鈉溶液的植入式膠囊滲透壓泵，A組、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液。飼養(yǎng)6周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法從4組大鼠中分別選取10只，檢測大鼠心體比(H/B)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變，免疫組化SABC法檢測JNK1、磷酸化JNK1(p-JNK1)、瞬時(shí)受體電位通道C亞族(TRPC)6、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)表達(dá)水平。結(jié)果B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組(P<0.05)；C組大鼠H/B、LVMI小于B組、D組(P<0.05)。A組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，心肌紋理清晰；B組、C組、D組大鼠心肌細(xì)胞均有不同程度的肥大性改變，細(xì)胞間隙增寬，心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌紋理欠清晰。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于A組(P<0.05)；C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平低于B組(P<0.05)；D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于B組、C組，JNK1表達(dá)水平高于C組(P<0.05)。結(jié)論高糖環(huán)境可誘導(dǎo)JNK1磷酸化，進(jìn)而影響下游TRPC6信號表達(dá)，造成膠原蛋白沉積過多，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和纖維化，從而引起糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

糖尿?。恍募〖膊。籧-junN端蛋白激酶1；瞬時(shí)受體電位通道C亞族

陳昕明，劉曉亮，吳偉.c-junN端蛋白激酶1磷酸化與糖尿病大鼠早期心肌損傷關(guān)系研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(27)：3281-3286.[www.chinagp.net]

CHEN X M,LIU X L,WU W.Relationship between c-junN terminal kinase 1 and early injury in the myocardium of diabetic rats[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3281-3286.

多數(shù)糖尿病(DM)患者死于心血管疾病，部分原因?yàn)樘禺愋孕募〔〉拇嬖赱1]，即糖尿病心肌病(DCM)[2]。DCM是DM引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛性壞死，早期常表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發(fā)生充血性心力衰竭[3-4]。但DCM的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。近年來研究認(rèn)為，可能存在c-junN端蛋白激酶1(JNK1)等信號分子通過瞬時(shí)受體電位通道C亞族(TRPC)影響下游信號造成心肌損傷，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確[5]。既往研究表明，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可以與血管緊張素Ⅱ 1型(AT-1)受體結(jié)合，通過活化AT-1受體而激活JNK1信號通路，在一系列心血管系統(tǒng)疾病以及代謝性疾病中起到重要作用[6-7]。SP600125是一種常用的JNK1信號通路高選擇性抑制劑，可以通過競爭性結(jié)合ATP位點(diǎn)抑制JNK1活性。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上[8]，探討JNK1磷酸化與DM大鼠早期心肌損傷的關(guān)系，尋找DCM發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以達(dá)到早期預(yù)防疾病、開發(fā)新型藥物乃至提供靶向治療的目的。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級雌性SD大鼠80只，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器與試劑鏈脲佐菌素(STZ)、AngⅡ購自美國Sigma公司，SP600125購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3研究方法

1.3.1動物模型制備及分組2013年10月—2014年7月，將80只SD大鼠于屏障環(huán)境大鼠飼養(yǎng)盒內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取60只作為DM模型組，給予高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周后，禁食24 h，期間自由飲水，一次性左下腹腹腔注射1% STZ溶液(35 mg/kg)，另外20只作為對照組(A組)，給予普通飲食飼養(yǎng)4周后，禁食24 h，期間自由飲水，一次性左下腹腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。分別于24 h、48 h后檢測血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L，餐后2 h血糖>16.7 mmol/L，且大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿?yàn)槌赡?biāo)準(zhǔn)。最終共48只大鼠造模成功，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為B組、C組、D組，各16只。C組大鼠腹腔注射SP600125(溶于1%二甲基亞砜)，15 mg/kg，隔日1次；D組大鼠皮下埋置含有AngⅡ+0.9%氯化鈉溶液的植入式膠囊滲透壓泵，700 ng·kg-1·d-1；A組、B組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，20 μg·kg-1·d-1。各組大鼠分組處理，連續(xù)飼養(yǎng)6周，其中A組大鼠繼續(xù)給予普通飲食，B組、C組、D組大鼠給予高糖高脂飲食，自由飲水。

1.3.2檢測大鼠心體比(H/B)、左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)飼養(yǎng)6周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法從4組大鼠中分別選取10只，稱取體質(zhì)量后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸骨，暴露心臟，于主動脈根部水平離斷，0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后，用濾紙吸干，稱全心質(zhì)量，分離左心室，稱左心室質(zhì)量。分別計(jì)算H/B(H/B=全心質(zhì)量/體質(zhì)量)及LVMI(LVMI=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.3.3HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變垂直于心臟縱軸常規(guī)組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，流動清水漂洗2 min，蘇木素染色5 min，再次流動清水漂洗1 min，1%鹽酸乙醇分化20 s，流動清水漂洗15 min返藍(lán)，伊紅染色1 min，流動清水漂洗30 s，85%乙醇脫水20 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇脫水1 min (2次)，無水乙醇脫水2 min(2次)，二甲苯脫水2 min(2次)，中性樹膠封固，觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4免疫組化SABC法檢測JNK1、磷酸化JNK1(p-JNK1)、TRPC6、膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ)表達(dá)水平將經(jīng)免疫組化染色處理過的切片置于顯微鏡下觀察，每份樣本觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野選取5處染色區(qū)，根據(jù)積分光密度與面積的比值，計(jì)算單位面積平均光密度(MOD)，以各個(gè)視野的MOD計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的MOD，以MOD作為JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagenⅠ表達(dá)水平的半定量參數(shù)。

2　結(jié)果

2.1一般情況A組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，毛色白，有光澤，無死亡。DM模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多食和消瘦等癥狀，且精神萎靡，動作遲緩，皮毛無光澤，部分出現(xiàn)爛尾、白內(nèi)障等癥狀。其中B組、D組上述癥狀較為明顯，B組死亡4只，D組死亡3只；C組上述癥狀相對較輕，死亡2只。

2.2H/B、LVMI比較4組大鼠H/B、LVMI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大鼠H/B、LVMI小于B組、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3心肌組織形態(tài)學(xué)改變A組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，心肌紋理清晰；B組大鼠心肌細(xì)胞有肥大性改變，細(xì)胞間隙增寬，心肌細(xì)胞排列明顯紊亂，細(xì)胞間組織疏松，且有局灶性壞死，心肌紋理欠清晰；C組大鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，細(xì)胞間組織疏松，心肌紋理欠清晰的現(xiàn)象較B組有所改善，但無法達(dá)到A組程度；D組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變較B組更為顯著(見圖1，本文圖1～5彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.4JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平比較4組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于B組、C組，JNK1表達(dá)水平高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2～5、表3)。

表1　4組大鼠H/B、LVMI比較

注：H/B=心體比，LVMI=左心室質(zhì)量指數(shù)；a為F值；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05；與C組比較，dP<0.05

Table 2Comparison of expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ among rats in four groups

組別只數(shù)JNK1p-JNK1TRPC6collagenⅠA組100.133±0.0150.150±0.0040.291±0.0480.141±0.021B組100.389±0.057a0.391±0.027a0.409±0.012a0.395±0.105aC組100.246±0.108ab0.201±0.016ab0.381±0.013ab0.295±0.141abD組100.431±0.012ac0.438±0.019abc0.442±0.018abc0.498±0.293abcH值23.73035.51834.31136.589P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：JNK1=c-junN端蛋白激酶1，p-JNK1=磷酸化JNK1，TRPC=瞬時(shí)受體電位通道C亞族，collagenⅠ=膠原蛋白Ⅰ；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

圖1　各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

圖2　4組大鼠心肌組織JNK1陽性表達(dá)情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖3　4組大鼠心肌組織p-JNK1陽性表達(dá)情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖4　4組大鼠心肌組織TRPC6陽性表達(dá)情況(免疫組化SABC法染色，×400)

圖5　4組大鼠心肌組織collagenⅠ陽性表達(dá)情況(免疫組化SABC法染色，×400)

3　討論

JNK1是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，可以受各種細(xì)胞外刺激而激活，表現(xiàn)為酪氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，即p-JNK1。TRPC6是位于細(xì)胞膜上的重要陽離子通道，是TRPC家族的重要亞型。DCM是DM患者的心血管并發(fā)癥之一，關(guān)于DCM的發(fā)生機(jī)制，以往主要圍繞糖脂代謝異常、離子紊亂、氧自由基異常等方面進(jìn)行研究[9]。JNK1信號通路是一系列心血管系統(tǒng)疾病以及代謝疾病中的關(guān)鍵因子，其中JNK1磷酸化起到重要作用[10]。心肌纖維化是DCM的重要病理表現(xiàn)之一，與心肌間質(zhì)膠原蛋白大量沉積有關(guān)，其中collagenⅠ是膠原蛋白的重要亞型。

本研究結(jié)果顯示，B組、C組、D組大鼠H/B大于A組，B組、D組大鼠LVMI大于A組，B組、C組、D組大鼠心肌細(xì)胞均有不同程度的肥大性改變、心肌紋理欠清晰，提示在DM早期即出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加，原因主要包括兩方面，一是心肌細(xì)胞肥大，二是間質(zhì)纖維增生。既往研究表明，JNK1磷酸化與胰島素抵抗、心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[11]，作為JNK1的下游基因，TRPC在鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要作用，TRPC相互結(jié)合形成同型或異型聚合體后，可形成非選擇性離子通道，鈣、鈉和鎂均可由此通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，是鈣池操縱性離子通道和受體操縱性離子通道的分子基礎(chǔ)，介導(dǎo)鈣內(nèi)流[12-13]。B組、C組、D組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于A組，提示高糖可以通過激活JNK1磷酸化，促進(jìn)TRPC6的表達(dá)，鈣通道的建立使心肌中鈣水平升高，活化多種心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化的相關(guān)基因，collagenⅠ大量表達(dá)、心肌間質(zhì)膠原沉積，心肌細(xì)胞蛋白核酸合成增加，造成心肌細(xì)胞肥大以及心肌纖維化[14]。既往研究中，TRPC抑制劑對于DM模型動物血管系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng)已經(jīng)得到初步證實(shí)，抑制TRPC表達(dá)可以減輕缺氧引起的心肌肥厚[15]，降低血管張力，減輕心臟負(fù)荷[16]。干擾RNA抑制TRPC6表達(dá)能明顯抑制心肌細(xì)胞肥大時(shí)的肌動蛋白重組和蛋白合成[17]。心肌細(xì)胞肥大依賴于TRPC6表達(dá)水平，低TRPC6表達(dá)水平心肌細(xì)胞無形態(tài)學(xué)改變，但已出現(xiàn)胚胎基因表達(dá)，并對肥大刺激因子敏感，隨著TRPC6表達(dá)水平增加，會出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加等形態(tài)學(xué)改變，且二者呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，C組大鼠JNK1、p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平較B組降低，表明阻斷TRPC6上游JNK1信號通路可明顯下調(diào)TRPC6表達(dá)水平，減少鈣離子內(nèi)流，抑制成纖維細(xì)胞增殖，減輕心肌細(xì)胞肥大及心肌纖維化，降低DCM病變程度。D組大鼠p-JNK1、TRPC6、collagen Ⅰ表達(dá)水平高于B組、C組，JNK1表達(dá)水平高于C組，這從另一方面驗(yàn)證了激活JNK1磷酸化對TRPC6的表達(dá)有促進(jìn)作用。DCM病理改變主要為心肌細(xì)胞肥大、變性、局灶性壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細(xì)胞外間質(zhì)不溶性膠原蛋白積聚、纖維化[19]。其中間質(zhì)纖維化是DCM致病重要因素之一，膠原蛋白大量沉積，增加心室壁的僵硬度，降低心室順應(yīng)性，致使心室舒縮功能不全。

人體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，JNK1信號通路受多種因素影響，單一的動物模型無法完全模擬DM患者的實(shí)際狀態(tài)，因此尚需大量臨床研究佐證本研究結(jié)果，今后需進(jìn)一步完善。

綜上所述，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)JNK1磷酸化，進(jìn)而影響下游TRPC6信號表達(dá)，造成膠原蛋白沉積過多，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和纖維化，從而引起DCM的發(fā)生發(fā)展。

作者貢獻(xiàn)：陳昕明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；陳昕明、劉曉亮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評估、資料收集；吳偉指導(dǎo)論文書寫，并進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Relationship between c-junN Terminal Kinase 1 and Early Injury in the Myocardium of Diabetic Rats

CHENXin-ming,LIUXiao-liang,WUWei.

DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,ChinaCorrespondingauthor:WUWei,DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;E-mail：wuwei196010@126.com

ObjectiveTo investigate the relationship between c-jun N terminal kinase 1 (JNK1) and early injury in the diabetic myocardium(DM) rats.MethodsFrom October 2013 to July 2014,after one-week adaptive feed of the 80 female Sprague-Dawley (SD) rats at SPF levels,60 rats were selected by random number table method.They were established as DM model group by four-week high glucose and high fat diet and a one-time left lower quadrant intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) at a dose of 35 mg/kg.The other 20 rats,one-time intraperitoneally injected of citrate buffer solution of same volume,were regarded as the control group (group A) with four-week normal diet.In the end,modeling of the 48 rats was established successfully.They were divided into group B,group C and group D with 16 rats in each group by random number table method.Rats in group C were given an intraperitoneal injection of SP600125,rats in group D were subcutaneously implanted with an osmotic pump to infuse angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) and 0.9% sodium chlo-ride,rats in group A and group B were given an intraperitoneal injection of 0.9% sodium chlo-ride.After six-week feeding,10 rats were selected from each group through random number table method.The heart/body weight ratio (H/B) and left ventricular mass index (LVMI) were detected.The Hematoxylin and Eosin staining were used to observe the myocardial pathological changes.Immunohistochemistry SABC method was used to measure the expression level of JNK1,phosphorylation JNK1 (p-JNK1),transient receptor potential canonical channels (TRPC) 6 and collagen Ⅰ.ResultsThe H/B in group B,group C and group D was higher than that in group A,and LVMI in group B and group D was higher than that in group A (P<0.05);H/B and LVMI of rats in group C were lower than those in group B and group D (P<0.05).The myocardial cells of rats in group A arranged in neat rows with tight junctions and clear myocardial texture;while the myocardial cells of rats in group B,group C and group D had hypertrophic changes of different degrees,characterized by dilated intercellular space,disordered cell arrangement and less clear myocardial texture.The expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group B,group C and group D was higher than that in group A (P<0.05);the expression level of JNK1,p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group C was lower that in group B (P<0.05);the expression level of p-JNK1,TRPC6,and collagen Ⅰ of rats in group D was higher than that in group B and group C,the expression level of JNK1 in group D was higher than that in group C (P<0.05).ConclusionHigh glucose environment may induce JNK1 phosphorylation,and affect the expression of TRPC6,which will lead to an increased collagen deposition,and finally result in cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis,and cause the occurrence and development of diabetic cardiomyopathy.

Diabetes mellitus;Cardiomyopathies;c-junN terminal kinase 1;Transient receptor potential canonical channels

全國臨床醫(yī)藥研究專項(xiàng)基金(L201257)；遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2013225049)

110001 遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科

吳偉，110001 遼寧省沈陽市，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科；E-mail：wuwei196010@126.com

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.005

2015-11-18；

2016-04-05)