盧從群，劉章鎖，張方興，郭 佳

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·論著·

帕立骨化醇抑制糖尿病腎病小鼠腎組織炎性反應研究

盧從群，劉章鎖，張方興，郭 佳

目的利用2型糖尿病腎病db/db小鼠模型，探討維生素受體激動劑帕立骨化醇對糖尿病腎病小鼠腎組織炎性反應的抑制作用。方法2015年1—11月，將60只雄性5周齡SPF級C57BLKS/J db/db小鼠采用隨機數(shù)字表法分為db/db-對照組(N組，n=20)、db/db-二甲基亞砜組(D組，n=20)、db/db-帕立骨化醇組(P組，n=20)，同窩出生的db/m小鼠作為正常對照組(C組，n=20)。10周齡時P組小鼠腹腔注射0.3 μg/kg帕立骨化醇，隔日1次，D組小鼠腹腔注射與P組等量的二甲基亞砜+0.9%氯化鈉溶液，N組和C組小鼠不做處理。干預12周后測定小鼠體質量、空腹血糖、24 h尿蛋白定量；留取腎組織并進行腎組織病理學檢查。應用實時熒光定量PCR、Western blotting和免疫組化檢測炎性因子白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA及其蛋白的表達水平。結果干預12周后，4組小鼠體質量、空腹血糖水平、24 h尿蛋白定量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中N組、D組和P組小鼠體質量、空腹血糖水平和24 h尿蛋白定量高于C組，P組小鼠24 h尿蛋白定量低于N組和D組(P<0.05)。病理學檢查顯示：C組腎小球及腎小管結構完整清晰；N組和D組可見腎小管間質局部炎性細胞浸潤，與C組比較，炎性反應明顯；P組腎臟病理改變較N組和D組減輕，炎性反應減輕。4組IL-6、TNF-α mRNA及其蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中N組、D組、P組IL-6、TNF-α mRNA及其蛋白表達水平均高于C組，P組IL-6、TNF-α mRNA及其蛋白表達水平均低于N組和D組(P<0.05)。免疫組化結果顯示，與C組比較，N組和D組腎組織IL-6、TNF-α表達上調；而P組腎組織IL-6、TNF-α表達較N組和D組下調。結論帕立骨化醇可減輕糖尿病腎病小鼠腎組織炎性反應，且該作用可能不依賴于降糖。

糖尿病腎病；帕立骨化醇；白細胞介素6；腫瘤壞死因子α

盧從群，劉章鎖，張方興，等.帕立骨化醇抑制糖尿病腎病小鼠腎組織炎性反應研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(27)：3275-3280.[www.chinagp.net]

LU C Q，LIU Z S，ZHANG F X，et al.Reaction of paricalcitol inhibition on kidney tissue inflammation in mice with diabetic nephropathy[J].Chinese General Practice，2016，19(27)：3275-3280.

糖尿病腎病(diabetic nephropathy)是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也是導致終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)最常見的疾病之一[1]。糖尿病腎病發(fā)病機制復雜，目前認為其是一種炎性疾病[2]。研究已證實，白介素(IL)-6、IL-18是參與糖尿病腎病的關鍵炎性因子[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，抗炎治療可以延緩糖尿病腎病的進展[4]。因此，從“抗炎”的角度研究糖尿病腎病的發(fā)病機制并尋找新的治療靶點已成為熱點。

帕立骨化醇是選擇性維生素D受體激動劑，開始時主要用于治療慢性腎臟病(chronic kidney disease)引起的繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進。目前研究顯示，帕立骨化醇可以抑制糖尿病腎病患者炎性反應[4]。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠模型中，帕立骨化醇能抑制腎臟單核細胞趨化因子1(MCP-1)表達、腎小球的硬化及腎小球巨噬細胞的浸潤[5]。目前維生素D受體激動劑的抗炎作用逐漸引起人們的重視，但是帕立骨化醇在糖尿病腎病中的抗炎研究不多。本研究以2型糖尿病db/db小鼠為研究對象，探討帕立骨化醇對糖尿病腎病炎癥的抑制作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物雄性5周齡SPF級C57BLKS/J db/db小鼠和同窩出生的db/m小鼠由南京大學模式動物中心提供，于河南省實驗動物中心動物房分籠飼養(yǎng)，4～5只/籠，室溫18～24 ℃，實驗期間自由進食飲水，喂養(yǎng)普通飼料，不使用胰島素和其他降糖藥物。

1.2主要實驗儀器和試劑安穩(wěn)血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)，超低溫冰箱(日本SANYO公司)，液氮容器(北京恒奧生物科技有限公司)，電子天平(ARI530型，美國OHAUS公司)，干式恒溫器(GL.150B型，海門市其林貝爾儀器)，公司制冰機(IEC-25型，蘇州雪尼)，數(shù)顯恒壓恒流電泳儀(EPS.300型)、轉移電泳槽(VE.186型)〔天能(Tanon)公司〕，核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)，帕立骨化醇(貨號：P126516-1 mg，CAS號：131918-61-1,上海阿拉丁有限公司)，4%多聚甲醛、二甲基亞砜(北京鼎國昌盛有限公司)，兔抗鼠單克隆抗體IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(Abcam)，實時熒光定量PCR利用cDNA合成試劑盒(FSQ-101,日本東洋紡公司)，KAPA SYBR快速定量PCR試劑盒(KR-0389,美國Kapa公司)，康為總RNA提取試劑盒(康為公司)。

1.3實驗動物分組及標本收集2015年1—11月，小鼠經(jīng)檢疫及適應性飼養(yǎng)1周，將60只db/db小鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組：db/db-對照組(N組，n=20)、db/db-二甲基亞砜組(D組，n=20)、db/db-帕立骨化醇組(P組，n=20)，db/m小鼠20只作為正常對照組(C組)。于10周齡時分別進行如下藥物干預：P組小鼠腹腔注射帕立骨化醇0.3 μg/kg(1 mg帕立骨化醇溶于5 ml二甲基亞砜中，用0.45 μm濾紙一次性小濾器過濾后裝入10 ml無菌管中常溫避光保存，每次使用前在無菌操作室取1 μl原液溶于5 ml無菌0.9%氯化鈉溶液中，使其終濃度為0.96×10-11nmol/L)，隔日1次，D組小鼠腹腔注射與P組等量的二甲基亞砜+0.9%氯化鈉溶液，N組和C組小鼠不做處理。干預12周后，腹腔注射5%水合氯醛0.1 ml/10 g麻醉小鼠，分離兩側腎臟，剝離腎包膜并留取腎臟，將腎皮質切成綠豆大小，在2 ml光鏡液中固定；剩余腎組織置于液氮中1 h后保存在-80 ℃冰箱備用。

1.4實驗方法

1.4.1體質量、空腹血糖檢測、24 h尿蛋白定量測量干預12周后，采用電子秤稱量小鼠體質量；小鼠禁食8 h后，采用剪尾法，利用安穩(wěn)血糖儀測量空腹血糖水平；采用代謝籠收集小鼠24 h尿液，利用全自動分析儀測量24 h尿蛋白定量。

1.4.2腎組織病理學檢查腎組織石蠟切片(厚4 μm)，進行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)結構的變化。

1.4.3實時熒光定量PCR采取液氮凍存的腎組織，取100 mg加入Trizol試劑1 ml，參照康為總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。1 μg RNA在10 μl反轉錄體系(RNA template 1 μg、5×RT Master Mix 2 μl、RNase free ddH2O 7 μl)經(jīng)37 ℃ 15 min、50 ℃ 5 min、98 ℃ 5 min擴增合成cDNA。將制備好的cDNA進行PCR擴增，擴增體系如下：KAPA SYBR快速定量PCR Master Mix 10 μl，引物(10 nmol/L)2 μl，雙蒸水6 μl，稀釋后的cDNA(5 mg/L)2 μl。反應體系為20 μl。PCR擴增條件：95 ℃酶激活3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共45個循環(huán)。引物均購于GeneCopoeia：GAPDH(Mm-QRP-20043)，IL-6(Mm-QRP-20563)，TNF-α(Mm-QRP-20147)。采用2-ΔΔct法計算IL-6、TNF-α mRNA表達水平。

1.4.4Western blotting采取液氮凍存的腎組織，加適量裂解液后充分研磨，4 ℃裂解組織，以12 000 r/min低溫離心2 min，離心半徑7 cm，取上清液，BCA法測蛋白濃度；99 ℃加熱變性5 min后上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入IL-6(1∶1 000)、TNF-α(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育過夜；加熒光標記的二抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h后TBST洗膜5 min×3次，采用紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像，以GAPDH為內參，采用Image J分析條帶并計算IL-6、TNF-α mRNA表達水平。

1.4.5免疫組化腎組織石蠟切片(厚4 μm)，脫蠟、水化，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，微波修復抗原，山羊血清封閉；分別滴加IL-6(1∶100)、TNF-α(1∶100)一抗，4 ℃孵育過夜；滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，顯微鏡下控制DAB顯色；蘇木素復染，脫水并封固。用磷酸鹽緩沖液(PBS) 替代一抗作陰性對照。免疫組化判斷標準：IL-6陽性細胞為深褐色顆粒，TNF-α陽性細胞為棕色部分。

2　結果

2.1各組小鼠體質量、空腹血糖、24 h尿蛋白定量比較干預12周后，C組、N組、D組、P組小鼠體質量、空腹血糖水平、24 h尿蛋白定量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中N組、D組和P組小鼠體質量、空腹血糖水平和24 h尿蛋白定量高于C組，P組小鼠24 h尿蛋白定量低于N組和D組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2各組小鼠腎組織病理學檢查結果C組腎小球及腎小管結構完整清晰，無明顯病理改變；N組和D組可見腎小管間質局部炎性細胞浸潤，與C組比較，炎性反應明顯；P組腎組織病理改變較N組和D組減輕，炎性反應減輕(見圖1，本文圖1、3彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.3各組小鼠腎組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較C組、N組、D組、P組IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中N組、D組、P組IL-6、TNF-α mRNA表達水平均高于C組，P組IL-6、TNF-α mRNA表達水平均低于N組和D組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.4各組小鼠腎組織IL-6、TNF-α表達水平比較C組、N組、D組、P組IL-6、TNF-α表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中N組、D組、P組IL-6、TNF-α表達水平均高于C組，P組IL-6、TNF-α表達水平均低于N組和D組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖2)。

2.5各組小鼠腎組織免疫組化結果免疫組化結果顯示，與C組比較，N組和D組腎組織褐色顆粒和棕色部分增多，說明IL-6、TNF-α表達上調；而P組較N組和D組褐色顆粒和棕色部分減少，說明IL-6、TNF-α表達下調(見圖3)。

Table 1Comparison of BMI,the fasting blood-glucose,24 hour urine protein quantitation of mice in each group after 12-week intervention

組別例數(shù)體質量(g)空腹血糖(mmol/L)24h尿蛋白定量(mg/24h)C組2024.9±1.14.2±1.22.2±0.1N組2064.0±3.2a20.9±5.1a20.9±1.4aD組2064.2±2.7a21.8±3.6a20.6±3.4aP組2063.9±4.9a24.2±4.4a14.0±2.1abcF值359.53055.105166.430P值<0.01<0.01<0.01

注：C組=正常對照組，N組=db/db-對照組，D組= db/db-二甲基亞砜組，P組= db/db-帕立骨化醇組；與C組比較，aP<0.05；與N組比較，bP<0.05；與D組比較，cP<0.05

注：C組=正常對照組，N組= db/db-對照組，D組= db/db-二甲基亞砜組，P組= db/db-帕立骨化醇組

圖1各組小鼠腎組織病理學檢查(HE染色，×200)

Figure 1Histopathological examination of renal tissue in each group

圖3　各組小鼠腎組織IL-6和TNF-α免疫組化結果(蘇木素染色，×200)

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α

圖2各組小鼠腎組織IL-6、TNF-α表達情況

Figure 2Expression of IL-6 and TNF-α of renal tissue in each group

Table 2Comparison of expression level of IL-6 and TNF-α mRNA of renal tissue in each group

組別例數(shù)IL-6mRNATNF-αmRNAC組201.01.0N組201.81±0.09a2.04±0.08aD組201.91±0.10a2.10±0.14aP組201.18±0.08abc1.53±0.13abcF值107.07572.530P值<0.01<0.01

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與C組比較，aP<0.05；與N組比較，bP<0.05；與D組比較，cP<0.05

Table 3Comparison of expression of IL-6 and TNF-α of renal tissue in each group

組別例數(shù)IL-6TNF-αC組200.25±0.010.36±0.03N組200.60±0.04a0.66±0.02aD組200.63±0.06a0.69±0.02aP組200.39±0.01abc0.46±0.05abcF值66.77066.690P值<0.01<0.01

注：與C組比較，aP<0.05；與N組比較，bP<0.05；與D組比較，cP<0.05

3　討論

糖尿病腎病是糖尿病引起的較常見的微血管并發(fā)癥，已成為導致ESRD的主要病因[6]。近年來研究認為，糖尿病腎病是一種代謝因素引發(fā)的慢性炎性反應疾病[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病動物模型及患者的腎臟中均有單核/巨噬細胞浸潤、T淋巴細胞激活及前炎性因子過表達，而且循環(huán)中炎性標志物及前炎性因子水平與腎損害密切相關[8]。糖尿病腎病的腎細胞，包括內皮細胞、系膜細胞、腎小球和腎小管上皮細胞均可合成炎性因子，進行性加重腎損害。

db/db小鼠是早期糖尿病腎病模型，由于db基因編碼的來普汀受體G到T位點突變導致缺損性受體的形成，這種缺失導致小鼠出現(xiàn)多食、肥胖、高胰島素血癥、胰島素耐受等癥狀，并逐漸發(fā)展為腎病，適用于長期研究[9]。本研究結果顯示，db/db小鼠體質量、空腹血糖水平、24 h尿蛋白定量較db/m小鼠明顯升高，說明db/db小鼠造模成功。

IL-6、TNF-α是體內多種細胞產(chǎn)生的一種具有廣泛生物活性的炎性因子，參與機體的各種病理生理過程。多種因素能夠誘導腎臟固有細胞如腎小球細胞、內皮細胞、小管細胞及系膜細胞合成、分泌一系列炎性因子，如IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子等[10]。已有研究證實，IL-6、TNF-α是參與炎性反應的主要因子，也是參與糖尿病腎病的關鍵炎性因子[10]。糖尿病腎病的腎小球系膜、腎間質、腎小管及浸潤的炎性細胞均高表達IL-6[11]。TNF-α可通過對腎細胞的直接損傷，活化細胞凋亡和壞死途徑，改變腎小球的血流動力學及減少腎小球濾過率(GFR)等介導糖尿病腎病的發(fā)生。動物實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎小球和近端小管上皮細胞中TNF-α mRNA及其蛋白表達水平增加[12]。本研究結果顯示，N組、D組小鼠腎組織IL-6、TNF-α mRNA及其蛋白表達水平均較C組升高；HE染色顯示，N組和D組小鼠腎組織見腎小管間質局部炎性細胞浸潤，與C組比較，炎性反應明顯；免疫組化結果也提示N組和D組小鼠腎組織IL-6、TNF-α表達上調，表明在糖尿病腎病中有炎性因子參與，與上述研究結果保持一致。

目前關于帕立骨化醇抑制炎性反應機制并不十分清楚。已有研究報道，維生素D受體激動劑對ESRD患者外周循環(huán)的單核細胞有生物學作用并可能改變炎性細胞表型[13]。GUO[14]發(fā)現(xiàn)活性維生素D可通過抑制TNF-α的表達、減輕炎性浸潤、減少蛋白尿，進而緩解腎損傷。本研究結果顯示，帕立骨化醇治療后，P組小鼠24 h尿蛋白定量減少，炎性因子IL-6、TNF-α mRNA及其蛋白表達水平較N組、D組降低，HE染色可見P組腎組織炎性浸潤減輕；免疫組化亦顯示P組IL-6、TNF-α表達下調。說明帕立骨化醇可以通過抑制糖尿病腎病的炎性反應，減少蛋白尿。此外，ZOU等[15]發(fā)現(xiàn)帕立骨化醇可降低糖尿病腎病小鼠腎組織促炎因子核因子(NF)-κB、MCP-1的活性，對炎性反應有抑制作用，且對血糖無明顯影響。因此，推測帕立骨化醇對腎組織炎癥狀態(tài)的抑制作用與血糖水平無關，具體機制有待研究。

綜上所述，帕立骨化醇可以通過抑制糖尿病腎病腎組織炎癥狀態(tài)，減少蛋白尿，進而保護腎臟，該作用可能不依賴于降糖。目前關于帕立骨化醇抑制炎性反應的機制有待進一步研究。

作者貢獻：盧從群進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張方興、郭佳進行實驗評估、資料收集；劉章鎖進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Reaction of Paricalcitol Inhibition on Kidney Tissue Inflammation in Mice with Diabetic Nephropathy

LUCong-qun，LIUZhang-suo，ZHANGFang-xing，GUOJia.

DepartmentofNephrology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，ChinaCorrespondingauthor：LIUZhang-suo,DepartmentofNephrology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China；E-mail：zhangsuoliu@sina.com

ObjectiveTo investigate the inhibiting effects of vitamin receptor agonist-parlicalcitol on the inflammatory reaction of kidney tissue in diabetic nephropathy mice by exploiting the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy.MethodsFrom January to November in 2015，under the method of random number table，we divided the 60 male five-week C57BLKS/J db/db mice of SPF level into three groups：db/db-control group(N group，n=20)，db/db-dimethyl sulfoxide group(D group，n=20)，and db/db-paricalcitol group(P group，n=20)，and we enrolled db/m mice of littermate as the normal control group(C group，n=20).At the age of 10 weeks，mice in P group were given intraperitoneal injection of paricalcitol at a dose of 0.3 μg/kg qod，the same amount of dimethyl sulfoxide as P group plus 0.9% sodium chloride solution were injected into D group，N and C group were not intervened.After 12-week intervention，we measured the body mass index，the fasting blood-glucose，24-hour urine protein quantitation；we retained the kidney tissue to make a renal histopathological examination.The expression of real-time fluorescent quantitative PCR，Western blotting，and immunohistochemical detection of inflammatory factor interleukin(IL)-6，and tumor necrosis factor-α(TNF-α)mRNA and the protein expression levels were applied.ResultsAfter 12-week medical intervention，the comparison of body mass，fasting blood-glucose，and the 24-hour urine protein quantitation in the four groups showed significant differences(P<0.01)；the body mass，fasting blood-glucose，the 24-hour urine protein quantitation of N group，D group and P group were higher than those of C group，the 24-hour urine protein quantitation of P group was lower than that of N group and D group(P<0.05).Pathological examination showed that the structure of the glomerulus and the renal tubular of C group was complete and clear；while there was partially inflammatory cell infiltration in renal tubulointerstitial in subjects of N group and D group，the inflammatory reaction was evident compared with C group；compared with N group and D group，the renal pathologic changes of P group reduced，and the inflammatory reaction alleviated.The IL-6，TNF-α mRNA and the protein expression level of the four groups were significantly different(P<0.01)；the expression levels of IL-6，TNF-α mRNA and protein of N group，D group and P group were all higher than those of C group，and the expression levels of IL-6，TNF-α mRNA and protein of P group were lower than those of N group and D group(P<0.05).Immunohistochemical results showed that compared with C group，the renal tissue expression of IL-6，TNF-α of N group and D group increased，and those of P group decreased compared with N group and D group.ConclusionParicalcitol can alleviate the inflammatory reaction in diabetic nephropathy mice kidney tissue，and the effect may not rely on reducing blood glucose.

Diabetic nephropathies；Paricalcitol；Interleukin-6；Tumor necrosis factor-alpha

國家自然科學基金資助項目(81400726)

450052 河南省鄭州市，鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎內科，河南省高校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室

劉章鎖，450052 河南省鄭州市，鄭州大學第一附屬醫(yī)院腎內科，河南省高校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室；E-mail：zhangsuoliu@sina.com

R 587.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.27.004

2015-12-26；

2016-05-16)