周亞敏,　吳魯艷,　白　雪,　何　飛,　石　剛,　倪才華

(江南大學化學與材料工程學院,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

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pH和還原雙重敏感性超支化納米膠束的制備及其釋藥性能

周亞敏,吳魯艷,白雪,何飛,石剛,倪才華

(江南大學化學與材料工程學院,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

將聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDGE)與胱胺(Cys)置于水溶液中,通過親核開環(huán)反應制備出超支化聚合物,并自組裝形成多核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束,再通過甲氨蝶呤(MTX)與納米膠束間的疏水作用制備出載藥膠束。用FT-IR、1H-NMR、DLS、SEM等方法對聚合物結(jié)構(gòu)和膠束粒徑與形貌進行表征,采用噻唑藍(MTT)法測試納米膠束和載藥膠束的細胞毒性。結(jié)果表明:聚合物經(jīng)過透析純化后自組裝形成納米膠束,其粒徑約為100 nm,呈均一球形;載藥膠束對MTX的載藥率為10.32%; 當載藥膠束處于模擬腫瘤環(huán)境中時,酸性和還原性條件可刺激藥物釋放。細胞毒性實驗表明,納米膠束具有優(yōu)良的生物相容性; 載藥膠束具有較強的抗腫瘤活性。

超支化納米膠束; 還原敏感性; pH敏感性; 甲氨蝶呤

納米藥物載體可以通過腫瘤組織的高滲透和滯留(EPR)效應實現(xiàn)藥物對腫瘤組織的的被動靶向性[1-3],從而大大提高藥物利用率并降低毒副作用。其中聚合物納米膠束[4]作為藥物載體具有增溶疏水性藥物、提高藥物穩(wěn)定性、緩釋藥物等優(yōu)勢。超支化聚合物[5-7]具有新穎的結(jié)構(gòu)和獨特的性能,如高溶解性、低黏度、內(nèi)部具有空腔三維球形結(jié)構(gòu)等,結(jié)構(gòu)中存在的大量空腔可以在疏水載藥的過程中提高藥物的載藥量。

為了使藥物在腫瘤組織處靶向釋放,目前研究較多的是具有環(huán)境智能響應性(如pH[8]、還原電勢[9]、酶等)的生物可降解載體。例如黃衛(wèi)等[10]制備了一種由疏水性二硫鍵和親水性磷酸酯鏈段交替分布于分子骨架中而形成的多核-殼結(jié)構(gòu)的超支化納米膠束,二硫鍵在10 mmol/L 谷胱甘肽(GSH)還原性條件下快速斷裂,膠束結(jié)構(gòu)遭到破壞從而實現(xiàn)藥物的靶向釋放。申有青等[11]合成了一種水溶性酸刺激可降解的聚酯類超支化聚合物,聚合物與藥物甲氨蝶呤(MTX)形成的鍵合物在水中呈單分子膠束,在酸性環(huán)境中被降解為無毒性的小分子并釋放出藥物。然而,這些合成方法通常需要多步完成,且需要用到大量有機溶劑。

本文提出一種簡單綠色制備超支化納米膠束藥物載體的方法。利用親水性的聚乙二醇二縮水甘油醚(PEGDGE)與含二硫鍵的胱胺(Cys)發(fā)生親核開環(huán)反應,制備出具有pH和還原雙重敏感性的超支化納米膠束。由于納米膠束結(jié)構(gòu)中存在大量的伯、仲、叔氨基團,使該納米膠束具有很強的質(zhì)子海綿效應[12],被溶酶體吞入后大量吸附質(zhì)子氫,引起Cl-和水分子內(nèi)流,導致溶酶體滲透性腫脹并最終破裂,載藥膠束進入細胞質(zhì)內(nèi),因此制備過程不需要使用有機溶劑。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

胱胺二鹽酸鹽(Cys·2HCl,w=0.98)、MTX(w=0.98):阿拉丁試劑有限公司; PEGDGE(w=0.98,Mn=352):廣州奧寶化工科技有限公司; 其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

采用美國Thermo Fisher Scientific公司Nicolet 6700型全反射傅里葉紅外光譜儀測定冷凍干燥后聚合物的紅外譜圖; 采用瑞士Bruker BioSpin公司AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振譜儀測定聚合物的1H-NMR; 采用德國HOSIC LIMITED公司ALV/DLS/SLS-5022F型激光光散射儀測定納米膠束在水溶液中的粒徑(D)及其分布(PDI),測試溫度為25 ℃; 采用美國布魯克海文公司ZetaPALS型Zeta電位及納米粒度分析儀測試納米膠束的ζ電位(pH=5.0,測試溫度為25 ℃); 采用日本東曹株式會社HLC-8320型凝膠滲透色譜儀測定納米膠束的分子量(流動相:H2O,標樣:聚乙二醇,測試溫度為25 ℃); 采用美國瓦里安有限公司Cary Esclipse型熒光分光光度計測定臨界膠束濃度(CMC),用芘作熒光探針; 采用日本日立株式會社S-4800(HR)型場發(fā)射掃描電子顯微鏡測定干燥狀態(tài)下納米膠束的形貌及粒徑; 采用上海盛磁儀器有限公司PHS-3C型精密pH計測定納米膠束的酸堿滴定曲線; 采用北京普析通用儀器有限責任公司TU-1950 紫外分光光度計測定納米膠束和載藥膠束溶液的吸光度。

1.2胱胺二鹽酸鹽的中和

參照文獻[13]的方法,稱取12.15 g粉末狀Cys·2HCl溶于16 mL去離子水,再加入60 mL乙醚和24 mL四氫呋喃,攪拌均勻。冰浴下將w=40% 的NaOH溶液(66.7 mL)逐滴滴入上述混合液中,磁力攪拌1 h后萃取分離,取上層有機相。再用50 mL乙醚及18 mL四氫呋喃的混合溶劑萃取下層水相。合并有機相,稱取4 g NaOH干燥2 h,過濾后真空旋蒸除去易揮發(fā)的乙醚和四氫呋喃,最終得到6.2 g無色油狀胱胺,產(chǎn)率為75.5%。

1.3超支化納米膠束的制備

將616 mg Cys溶入8 mL超純水中,磁力攪拌使其完全溶解,向其中滴加PEGDGE(2.873 g)的水溶液(8 mL),在60 ℃下磁力攪拌反應24 h。將產(chǎn)物溶液倒入透析袋(截留分子量為3 500)中,在超純水中透析3 d,每隔4 h換一次透析液,在透析的過程中形成超支化納米膠束,記為CP12。通過調(diào)節(jié)Cys與PEGDGE的物質(zhì)的量之比,可以制得一系列的超支化納米膠束,如表1所示,再經(jīng)冷凍干燥可得到相應固態(tài)超支化聚合物CP。

1.4載藥膠束的制備

取0.5 mg/mL超支化納米膠束溶液20 mL,向其中添加0.1 mg/mL的MTX溶液10 mL,室溫下避光磁力攪拌24 h后轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量為3 500)中透析24 h,每隔3 h換一次透析液,將載藥膠束用0.45 μm微孔濾膜避光過濾,所得載藥膠束為淡黃色,記為CP-MTX。

1.5酸堿滴定曲線的繪制

取10 mg/mL超支化納米膠束溶液5 mL,向其中緩慢滴加1.0 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,接著用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定,繪制滴定曲線。

1.6藥物釋放實驗

取4份5 mL透析后的載藥膠束裝入透析袋(截留分子量為3 500)內(nèi),分別置于50 mL不同 pH(7.4和5.0)含10 mmol/L(或無)GSH的醋酸鹽緩沖溶液中,在(37±0.5) ℃的恒溫震蕩器中回旋震蕩,每隔一段時間取3 mL樣品測試吸光度(A388),通過標準曲線計算釋放液中MTX的質(zhì)量濃度,同時補充相同體積的新鮮介質(zhì)以維持緩沖溶液體積不變。

1.7體外細胞毒性實驗

采用噻唑藍(MTT)法分別檢測納米膠束和載藥膠束對3T3和Hela細胞的毒性,實驗步驟如下:用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基將3T3細胞和Hela細胞分別種植于96孔板上(104cells/mL),37 ℃下培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,向孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的納米膠束和載藥膠束,每組設(shè)6個復孔,培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去培養(yǎng)板中的溶液,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),搖勻,用酶標儀于570 nm處測定光學密度值(OD),并計算細胞存活率。

2　結(jié)果與討論

2.1納米膠束的制備

Cys中的雙端氨基與PEGDGE中的雙端環(huán)氧基容易發(fā)生親核開環(huán)反應[13],聚合形成具有三維立體空腔結(jié)構(gòu)的兩親性超支化聚合物,其中疏水的二硫鍵具有還原敏感性,使其可以實現(xiàn)藥物在腫瘤部位的靶向釋放,而親水的PEG部分則具有優(yōu)良的生物相容性。納米膠束骨干柔韌性極好,在相分離階段可以輕易地容納構(gòu)象改變。因此,在選擇性溶劑中,分子內(nèi)和分子間可以很快發(fā)生微相分離,進而形成多核-殼膠束結(jié)構(gòu)[10]。納米膠束在溶酶體pH(pH≈5.0)下顯正電性,通過與負電性細胞膜間的靜電相互作用使其具備輕松通過細胞膜的能力,從而使其進入癌細胞的傾向大大提高。其具體配方如表1所示。

表1　超支化納米膠束的配方及其性質(zhì)

2.2超支化聚合物的結(jié)構(gòu)表征

圖1為各超支化聚合物的紅外光譜圖。Cys的端氨基與PEGDGE的環(huán)氧基團發(fā)生氨基開環(huán)反應后,在3 386 cm-1處為生成的羥基的伸縮振動峰,可能是因為生成的羥基與端氨基形成了氫鍵,因而此處峰型較寬。聚合物端—NH2在3 500～3 250 cm-1處本應有2個吸收峰,但被—OH峰覆蓋住,故紅外譜圖上看不出此處—NH2的峰。在1 636 cm-1處為聚合物端—NH2的面內(nèi)彎曲振動峰; 在1 093 cm-1處為脂肪族醚鍵的強伸縮振動峰。以上3個主要吸收峰說明反應物Cys和PEGDGE發(fā)生了氨基環(huán)氧開環(huán)反應。

圖2為超支化聚合物CP12的核磁共振氫譜圖。通過圖2可知,胱胺亞甲基(-SS-CH2-CH2-)以及PEG中亞甲基(-O-CH2-)的特征質(zhì)子峰分別在2.82和3.50處出現(xiàn)[14],證明超支化聚合物合成成功。

2.3納米膠束的粒徑形貌分析

圖3為納米膠束的掃描電鏡圖。可以看出:膠束CP12具有粒徑小(約100 nm)、分布窄以及形貌規(guī)整均一的特點。隨著Cys投料比的增加,粒徑整體呈逐漸增大的趨勢。

圖1　超支化聚合物的紅外光譜圖

2.4納米膠束的還原敏感性分析

圖4反映了CP12納米膠束在10 mmol/L GSH水溶液中孵育不同時間后的粒徑變化情況。如圖4所示,隨著時間的推延,粒子的粒徑不斷減小。這是因為GSH分子中所含的巰基(—SH)具有較強的還原性,—SH能夠與聚合物骨架中的二硫鍵(S—S)發(fā)生交換反應,使得聚合物的二硫鍵斷裂,破壞納米膠束結(jié)構(gòu)。

2.5納米膠束的pH敏感性分析

圖5為納米膠束溶液和對照組NaCl溶液的酸堿滴定曲線圖。由圖5可知,在NaCl溶液中無緩沖平臺,而納米膠束溶液在pH由7.4降至5.0期間緩沖能力按CP32、CP22、CP12、CP13依次下降,之所以具有緩沖作用是因為納米膠束結(jié)構(gòu)骨架中的氨基具有吸附質(zhì)子氫的能力。這種緩沖能力有利于CP-MTX的溶酶體逃逸[12],從而使藥物能夠快速有效地進入細胞核發(fā)揮藥效。

圖4　CP12納米膠束在37 ℃ GSH水溶液(10 mmol/L)中孵育不同時間后的粒徑變化

圖5　納米膠束的酸堿滴定曲線

2.6MTX的體外釋放

圖6　載藥膠束CP12-MTX在37 ℃不同介質(zhì)下對MTX的體外釋放曲線

圖6為載藥膠束CP12-MTX在不同介質(zhì)下對MTX的體外釋放曲線。可以看出,在還原性介質(zhì)(10 mmol/L GSH)存在下,藥物釋放率普遍比在非還原性介質(zhì)中高出50%左右,這是因為在GSH的作用下,還原敏感性的二硫鍵斷裂,納米膠束解體,所載的藥物得以釋放。

因為低氧的微環(huán)境及癌細胞的酸性細胞器,腫瘤病灶處較正常組織處呈明顯酸性,納米膠束在pH=5.0處比在pH=7.4下更有利于MTX的釋放。這可能是因為CP12膠束的質(zhì)子海綿效應,在酸性條件(pH=5.0)下,超支化納米膠束結(jié)構(gòu)中的氨基質(zhì)子化,使得整個納米膠束高度正電性,從而使結(jié)構(gòu)內(nèi)部產(chǎn)生高強度的靜電斥力,使結(jié)構(gòu)松散,從根本上使藥物釋放增強。

2.7細胞毒性分析

圖7(a)為3T3細胞和Hela細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度納米膠束CP12處理24 h后的細胞存活率圖?？梢钥闯?3T3和Hela的細胞存活率均在90%以上,說明納米膠束對細胞幾乎沒有毒性,生物相容性很好。圖7(b)為不同質(zhì)量濃度游離藥物和載藥膠束對Hela細胞處理24 h后的抗腫瘤活性圖?？梢苑治龀?游離藥物MTX和載藥膠束CP12-MTX對Hela細胞的半抑制濃度(IC50)分別是0.024 μg/mL和0.07 μg/mL。相同藥物濃度下,載藥膠束較游離藥物的毒性要略低一些,說明載藥膠束對藥物MTX具有緩釋作用。

圖7　3T3和Hela細胞在不同質(zhì)量濃度納米膠束CP12下的存活率(a); 相同藥物濃度下游離藥物和載藥膠束CP12-MTX對Hela細胞的抗腫瘤活性(b)

3　結(jié)　論

通過PEGDGE與Cys的親核開環(huán)反應,在水溶液中合成了具有pH和還原雙重敏感性的納米膠束; 利用疏水載藥和超支化聚合物的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu),可將藥物的載藥率提高至10.32%,體外釋放顯示了顯著的pH和還原敏感性;該納米膠束具有優(yōu)良的生物相容性,具有作為抗癌藥物載體的應用前景。

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Preparation and Drug Release Properties of pH/Redox-Responsive Hyperbranched Nano Micelles

ZHOU Ya-min,WU Lu-yan,BAI Xue,HE Fei,SHI Gang,NI Cai-hua

(Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology of Ministry of Education,School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China)

Hyperbranched nano micelles with a multi-core-shell structure were prepared via the nucleophilic ring-opening reaction of poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDGE) and cystamine (Cys) in aqueous solution.The drug methotrexate (MTX) was loaded into nano micelles through hydrophobic interactions between MTX and nano micelles to form drug-loaded micelles.The chemical structure and morphology of the micelles were characterized by FT-IR,1H-NMR,DLS and SEM.The cytotoxicity of nano and MTX-loaded micelles were studied by Methyl Thiazolyl Tetrazolium(MTT) assays.Results showed that the hyperbranched nano micelles had spheric morphology with an average diameter of 100 nm and narrow dispersity.MTX-loaded micelles had drug loading content of 10.32%.The release of MTX was stimuli-responsive under an acidic and reductive condition which simulated the intracellular environment of tumors.MTT assays demonstrated that nano micelles were highly biocompatibleinvivo,while MTX-loaded micelles caused pronounced cytotoxic effects to Hela tumor cells.

hyperbranched nano micelles; redox-responsive; pH-responsive; methotrexate

1008-9357(2016)03-0346-006

10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.03.015

2015-12-08

國家自然科學基金(21401079); 江蘇省科技支撐計劃-工業(yè)部分(BE2012017)

周亞敏(1989-),女,安徽安慶人,碩士生,主要研究方向為生物醫(yī)用材料。E-mail:1426842802@qq.com

倪才華,E-mail:nicaihua2000@163.com

O636.9

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