王文麗，李冬梅，施　雷

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，沈陽(yáng)　110032；2.沈陽(yáng)市皇姑區(qū)中醫(yī)院，沈陽(yáng)　110032）

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·實(shí)驗(yàn)研究·

肝肺同治祛風(fēng)方治療咳嗽變異性哮喘模型大鼠的療效觀察*

王文麗1，李冬梅1，施雷2

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，沈陽(yáng)110032；2.沈陽(yáng)市皇姑區(qū)中醫(yī)院，沈陽(yáng)110032）

［目的］觀察肝肺同治祛風(fēng)法對(duì)咳嗽變異性哮喘（CVA）大鼠模型的療效。［方法］將72只大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、激素吸入組、清肺祛風(fēng)組、清肝熄風(fēng)組、肝肺同治組，制備咳嗽變異性哮喘肝郁肺虛病證結(jié)合大鼠模型，觀察各組大鼠一般狀態(tài)、肺支氣管病理組織形態(tài)、支氣管肺泡灌洗液（BALF）嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)定血清IgE水平的變化。［結(jié)果］與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組CVA大鼠支氣管管腔狹窄，黏膜增厚，支氣管壁及可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，BALF涂片EOS計(jì)數(shù)顯著升高，血清中IgE的含量顯著升高，與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。激素治療組及各中藥治療組，各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著改善，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01），以激素治療組及肝肺同治組指標(biāo)改善最為顯著。［結(jié)論］肝肺同治法可改善肝郁肺虛的中醫(yī)證候，降低CVA模型大鼠慢性氣道炎癥反應(yīng)，調(diào)整免疫異常。

咳嗽變異性哮喘；大鼠；肝郁肺虛；肝肺同治；IgE

咳嗽變異性哮喘（CVA）是以反復(fù)發(fā)作的慢性咳嗽為特征的一種特殊類型哮喘，兒童患病率為0.77%～5.0%［1］。由于CVA的臨床表現(xiàn)不典型，缺乏特異性，常被忽視或誤診，可能會(huì)給予抗生素長(zhǎng)期治療而療效不佳［2］。有研究發(fā)現(xiàn)其復(fù)發(fā)率較高達(dá)30%，可能與患者經(jīng)常接觸過(guò)敏原有關(guān)［3］。CVA發(fā)病迅速、陣發(fā)性、易反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)與風(fēng)邪為“百病之長(zhǎng)，善行數(shù)變”、“其性輕揚(yáng)，風(fēng)盛則攣急”的特點(diǎn)相似。外風(fēng)責(zé)之于肺，內(nèi)風(fēng)責(zé)之于肝，肝郁肺虛，木火刑金，肝肺同病則發(fā)為咳嗽。中醫(yī)藥在防治兒童CVA方面具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，可以彌補(bǔ)西醫(yī)治療的不足［4］，本研究通過(guò)觀察自擬肝肺同治祛風(fēng)方對(duì)CVA模型大鼠氣道慢性炎癥的作用，觀察其改善氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥的效應(yīng)，探討從風(fēng)論治CVA作用機(jī)制。

1　材料與儀器

1.1動(dòng)物4周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠72只，體質(zhì)量（100±10）g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司（許可證編號(hào)：［動(dòng)］SCXK（遼）2010-0001）。

1.2試劑卵蛋白（ovalbumin OVA）：Sigma公司，GradeII；氫氧化鋁的生理鹽水溶液沈陽(yáng)市試劑三廠（批號(hào)：080714）；辣椒素溶液：上海紫一試劑公司（批號(hào)：20110514）；IgE酶聯(lián)免疫試劑盒：（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3藥物普米克令舒（吸入用布地奈德）：葛蘭素史克制藥（重慶）有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010389，購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院西藥局。清肺祛風(fēng)方（黃芩、荊芥、蟬蛻、防風(fēng)、甘草），清肝熄風(fēng)方（地龍、鉤藤、白芍、五味子、甘草），肝肺同治方（黃芩、荊芥、蟬蛻、防風(fēng)、地龍、白僵蠶、鉤藤、白芍、五味子、麥門冬、甘草）諸藥材，購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中草藥局，經(jīng)藥師鑒定為道地藥材。常規(guī)水煎煮，濃縮為每毫升1 g生藥溶液，備用。

1.4儀器透明霧化吸入箱，自制；INQUA NEBplus型壓縮霧化吸入機(jī)，INQUA GmbH公司，德國(guó)；精密轉(zhuǎn)輪切片機(jī)（LEICA RM2135）；系統(tǒng)生物顯微鏡（OLYPUS BX50F4）。

2　方法

2.1造模與分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、激素吸入組、清肺祛風(fēng)組、清肝熄風(fēng)組、肝肺同治組，每組均12只。清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)室溫下常規(guī)飼養(yǎng)7 d，自由食水，記錄各組大鼠體質(zhì)量、呼吸、進(jìn)食水量、肛溫情況。

造模方法：卵蛋白氫氧化鋁致敏激發(fā)CVA大鼠，煙熏方法復(fù)制肺氣虛大鼠模型［5］，長(zhǎng)期激怒法建立肝氣郁結(jié)、肝火犯肺動(dòng)物模型［6-7］，采用復(fù)合因素建立CVA肝郁肺虛病證結(jié)合動(dòng)物模型［8］。

2.2給藥造模第16日，第1次卵蛋白生理鹽水溶液霧化激發(fā)次日開(kāi)始給藥，霧化攻擊前30 min灌胃給藥，非霧化日常規(guī)給藥，連續(xù)給藥15 d。中藥治療組每日灌胃等效劑量中藥復(fù)方［9］，每日每千克體質(zhì)量12 g生藥量，每日1次，共15 d。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及激素治療組灌胃等量生理鹽水。激素治療組大鼠放入透明霧化箱中，噴入普米克令舒生理鹽水溶液，吸入量為0.6 mL/kg體質(zhì)量，濃度為20%，每日1次，共15 d。

2.3標(biāo)本處理造模第30天，辣椒素激發(fā)引咳試驗(yàn)后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔，心臟穿刺取血，置于普通試管，靜置30 min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?。結(jié)扎右主支氣管，分離右肺上、中、下葉，右肺中葉置于新鮮配制的中性4%多聚甲醛固定液中。

支氣管肺泡灌洗液（BALF）回收：以眼科剪在氣管上剪一斜口，插管，把針頭和氣管一起固定結(jié)扎，左肺肺泡灌洗，分別取0.8、0.8、0.5 mL，0.01 mol/L PBS依次灌洗3次，灌洗液回收率＞90%。BALF于1 500 r/min離心10 min，細(xì)胞沉淀用1 mL PBS重懸，取約30 μL細(xì)胞懸液，甩片晾干，95%的乙醇固定，常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，得出嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。

2.4觀測(cè)指標(biāo)大鼠一般狀態(tài)觀察、肺支氣管病理組織形態(tài)學(xué)觀察、BALF嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、ELISA法檢測(cè)血清IgE含量。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行錄入及分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1大鼠一般狀態(tài)觀察造模前各組大鼠體質(zhì)量、呼吸、進(jìn)食水量、肛溫等情況基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，呼吸平穩(wěn)，行動(dòng)靈活，反應(yīng)靈敏，毛色光澤。模型組體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯減慢，各治療組體質(zhì)量較模型組增長(zhǎng)明顯，但仍低于正常對(duì)照組。模型組及各治療組霧化激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安、拱背蜷縮，皮毛黃濕無(wú)光澤，時(shí)有脫落，消瘦，呼吸急促、咳嗽喘息等癥狀。

3.2大鼠肺、支氣管形態(tài)學(xué)檢測(cè)正常對(duì)照組肺內(nèi)各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)正常，支氣管壁及其周圍組織結(jié)構(gòu)清晰，支氣管管壁和平滑肌厚度正常，支氣管上皮細(xì)胞完整，管腔內(nèi)無(wú)脫落細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。肺泡上皮完整，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血、缺血，肺泡腔內(nèi)清潔無(wú)滲出，可見(jiàn)少量嗜酸性粒細(xì)胞。模型對(duì)照組支氣管管腔狹窄，黏膜增厚，支氣管上皮纖毛倒伏、缺失，上皮細(xì)胞脫落。肺泡腔增大，肺泡間隔及氣道平滑肌明顯增厚，細(xì)支氣管管腔擴(kuò)大，黏液分泌增多，可見(jiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，各治療組支氣管組織病理變化明顯減輕，激素治療組、肝肺同治組織病理改善更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1　大鼠肺、支氣管組織病理（HE染色×200）Fig.1　Pathology figure of lung and bronchia in rats（HE×200）

3.3BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組BALF涂片EOS計(jì)數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，各治療組EOS計(jì)數(shù)明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其中以激素治療組、肝肺同治組降低最明顯。見(jiàn)表1。

表1　BALF嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)（±s）Tab.1　BALF EOS count（±s）

表1　BALF嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)（±s）Tab.1　BALF EOS count（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別　動(dòng)物數(shù)　EOS（個(gè)/200個(gè)細(xì)胞）正常對(duì)照組　12　1.55±1.23模型對(duì)照組　11　32.46±5.62*激素治療組　12　7.58±4.55*#清肺祛風(fēng)組　12　12.48±2.56*#清肝熄風(fēng)組　12　15.62±5.74*#肝肺同治組　12　8.32±3.47*#

3.4ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IgE含量與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IgE含量顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，各治療組IgE的含量明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其中以激素治療組、肝肺同治組降低最明顯。見(jiàn)表2。

表2　ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IgE的含量（±s）Tab.2　Detection IgE of serum in rats by ELISA（±s）

表2　ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IgE的含量（±s）Tab.2　Detection IgE of serum in rats by ELISA（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與激素治療組比較，△P＜0.05。

組別　動(dòng)物數(shù)　IgE（U/mL）正常對(duì)照組　12　6.53±1.25模型對(duì)照組　11　21.22±2.01*激素治療組　12　9.58±1.46#清肺祛風(fēng)組　12　15.48±1.95#△清肝熄風(fēng)組　12　13.45±2.11#△肝肺同治組　12　10.26±1.64#

4　討論

CVA傳統(tǒng)中醫(yī)病因病機(jī)為為宿痰伏肺、復(fù)感外邪，遇外感引觸［10］，《景岳全書》［11］指出：“喘有夙根，遇寒即發(fā)，或遇勞即發(fā)者，亦名哮喘?！薄镀諠?jì)本事方》［12］中述“此癥有苦至終身者，亦有母子相傳者”。CVA表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的刺激性干咳，具有陣發(fā)性、痙攣性的特點(diǎn)，常伴有鼻塞、流涕、鼻癢等癥狀［13］，與中醫(yī)“風(fēng)”發(fā)病迅速、“善行而數(shù)變”、“風(fēng)盛則癢”的致病特點(diǎn)相符，提示風(fēng)邪是本病發(fā)生、發(fā)展和演變過(guò)程中主要致病因素［14］。小兒為稚陰稚陽(yáng)之體，素體肺虛易感外風(fēng)，CVA病初患兒見(jiàn)鼻塞、咽癢、流涕、鼻癢，為外風(fēng)襲肺；內(nèi)風(fēng)者，乃肝木化風(fēng)所致，小兒素體肺常不足、肝常有余，既有金行的虛弱不足，又有木行的過(guò)于亢盛，則肺金易被肝木反克。素體陰虛，水不涵木，陰虛風(fēng)動(dòng)而內(nèi)風(fēng)上擾，木叩金鳴而咳。CVA患兒先天稟賦不足，具有特應(yīng)性體質(zhì)，易生風(fēng)化痰?！蹲x醫(yī)隨筆》［15］曰“凡病之氣結(jié)……哮喘，皆肝氣不能舒暢所致也。”李彥君等［16］也認(rèn)為，一旦感受風(fēng)寒之邪氣，外風(fēng)引動(dòng)內(nèi)在的伏風(fēng)，內(nèi)外之邪相合，導(dǎo)致肺失宣降，發(fā)生CVA。所以，CVA患兒常由于治不得法而外邪不解，邪郁于肺，引動(dòng)內(nèi)風(fēng)，風(fēng)動(dòng)上擾，內(nèi)外風(fēng)相合則金鐘動(dòng)搖，宣肅失司，發(fā)為咳嗽［17］。

本研究以卵蛋白氫氧化鋁致敏激發(fā)CVA大鼠，模型大鼠出現(xiàn)呼吸急促、煩躁、咳嗽、前肢縮抬、腹肌收縮、可聞及哮鳴音等呼吸道痙攣癥狀，符合CVA臨床特點(diǎn)［18］。以中醫(yī)五行生克制化理論為依據(jù)，模擬中醫(yī)傳統(tǒng)病因，選擇幼齡大鼠，取其幼齡肺常不足，煙熏致肺氣益虛，易感外風(fēng)；幼鼠素體陰常不足、陰液虧虛，長(zhǎng)期激怒使肝氣郁結(jié)，肝木化風(fēng)，木火刑金，肺虛肝旺。模型大鼠煙熏過(guò)程中，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、食量減少、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、間斷咳嗽，提示肺虛；大鼠煩躁不安，抓咬模具，易激惹，自發(fā)活動(dòng)增多提示肝氣郁結(jié)，肝陽(yáng)上亢；呼吸急促，無(wú)刺激狀態(tài)下咳嗽次數(shù)較正常組增多提示肝氣犯肺，肝陽(yáng)化風(fēng)。

在辨證論治的基礎(chǔ)上，依據(jù)方劑的功效或其組成藥物的功效推測(cè)或反證其對(duì)應(yīng)證候的屬性［19-20］，即為以方測(cè)證。本CVA肝肺通病證候病位在肺，病本在肝，應(yīng)重在肝肺同治，故用自擬肝肺同治方。以黃芩、荊芥、蟬衣、防風(fēng)清肺止咳化痰；地龍、僵蠶、鉤藤清肝瀉火、止咳平喘，白芍、五味子、麥冬、甘草養(yǎng)陰柔肝。內(nèi)外合治，使肝火不刑肺金，則肺宣肅復(fù)常，咳嗽自止。研究結(jié)果顯示，肝肺同治祛風(fēng)法可以減輕大鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、大鼠氣道病理組織變化及降低血清IgE水平。尤其在改善肝火犯肺的中醫(yī)證候方面，明顯優(yōu)于激素治療組，提示中醫(yī)辨證治療即可以有效改善患兒氣道慢性炎癥反應(yīng)，同時(shí)可能改善CVA患兒煩躁、多動(dòng)等的中醫(yī)證候，提高患兒生存質(zhì)量。

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（本文編輯：馬英，于春泉）

Observation on the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats

WANG Wen-li1，LI Dong-mei1，SHI Lei2
（1.Department of Paediatrics，The Affiliated Hospital of LiaoningUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Huanggu District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

［Objective］To investigate the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats. ［Methods］The combination of disease and syndrome animal model of CVA rats was established by traditional Chinese medicine（TCM）etiology and Western medicine etiology pathology，then they were randomly divided into normal group，model group，hormone inhaling group，clear lung heat and eliminating wind evil method group，clear liver to stop wind group，both lung and Liver treatment group. Observation the rat general state，spontaneous activity，cough response，bronchial lung pathology organization form，bronchoalveolar lavage fluid（BALF）eosinophil count and serum IgE.［Results］Comparison with normal rats，the bronchial lumen of the model group rats were stenosis，mucosal thickening，numerous eosinophils infiltration on bronchial wall，the EOS counting was significant rise in BALF smear，the content of serum IgE was significantly increased（P＜0.01）.Comparison with model rats，bronchial lung pathology，the EOS counting and serum IgE content of hormone inhaling group and TCM treatment group were significantly increased（P＜0.01），especially the hormone inhaling group and treating both lung and liver group.［Conclusion］Treating lung and liver together could significantly improved the TCM syndrome of liver depression and lung deficiency，reduced the chronic airway inflammation of CVA model rats and regulate the immune abnormalities.

cough variant asthma；rat；liver depression and lung deficiency；treating lung and liver together；IgE

R562.25

A

1672-1519（2016）08-0472-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.08

2016-03-30）

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目（L2013368）。

王文麗（1974-），女，博士研究生，副主任中醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治小兒咳喘病證研究。