張玉楓，張金華，黃　瑤，李開秀，楊莉娜，王　丹

（1.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川 成都 610500；2.中國科學院環(huán)境與應用微生物重點實驗室，四川 成都 610041）

響應面法優(yōu)化紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的提取工藝研究

張玉楓1，張金華1，黃瑤1，李開秀1，楊莉娜2，王丹1

（1.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系，四川 成都 610500；2.中國科學院環(huán)境與應用微生物重點實驗室，四川 成都 610041）

為建立紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝，在單因素實驗的基礎上，選取提取時間、乙醇體積分數(shù)和固液比為自變量，抑菌圈直徑為響應值，建立數(shù)學模型，求解得到最佳提取條件和理論最大抑菌圈并驗證。結果顯示，紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)73%，提取時間78min，固液比1∶31g/mL。此時，紅花酢漿草醇提取物拮抗金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為30.17mm，較優(yōu)化前提高67.61%。響應面優(yōu)化法不僅效率高，而且可靠性強，可準確預測抑菌圈直徑。同時，證明紅花酢漿草的醇提取物具有較為廣泛的抑菌譜。

紅花酢漿草；抑菌活性；響應面法；抑菌譜；提取工藝

0　引　言

目前，抗生素濫用引起的致病菌株耐藥問題日趨嚴重[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥抗菌譜廣、副作用小、耐藥性低，同時兼具來源廣泛、價格低廉等優(yōu)點[3-4]；因此，篩選抗菌中草藥、探究其作用機制逐漸成為研究熱點[5-6]。紅花酢漿草（Oxalis corymbosa）又名三葉草、大酸味草等，原產(chǎn)巴西和南非好望角，在我國分布廣泛[7]。作為一種傳統(tǒng)中藥，紅花酢漿草常用于治療咽峽炎、扁桃體炎、腮腺炎等疾病[8]。目前，已證實酢漿草中富含多種生物活性物質(zhì)，如β-谷甾醇、β-生育酚、胡蘿卜苷、酒石酸等[9-10]。其中，黃酮類、總酚類物質(zhì)具有較強的抗菌及抗氧化等生物活性[11-12]。本課題組在前期研究中，分別以細菌、真菌作為指示菌，利用杯碟法檢測黃葛蘭紫荊、馬蓼、千里香等20種植物的抑菌活性，其中紅花酢漿草乙醇提取物的抑菌活性最佳，且抑菌譜廣泛。此外，和正交試驗相比，響應曲面法采用多元二次回歸方法，通過研究因素與因素間的交互作用，對擬合后的回歸方程進行分析，篩選最佳提取條件，同時能直觀地分析各因素的相互影響，試驗周期短，結果更加直觀、可靠[13-14]。因此，本文利用響應面法優(yōu)化紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的提取工藝。

1　材料與儀器

1.1藥品與試劑

紅花酢漿草，采自成都植物園及成都醫(yī)學院校園；乙醇、氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等均為分析純，購自成都科龍公司。

1.2菌種與培養(yǎng)基

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏桿菌（Salmonella enteritidis）等細菌；白色念珠菌（Monilia albican）、八孢裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）、漢遜酵母（Hansenula polymorpha）、假絲酵母（Candida albicans）、隱球酵母（Cryptococcus neoformans）、土曲霉（Aspergillus terreus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、放射毛霉（Actinomucor elegans）、綠色木霉（Trichoderma viride）等真菌保存于成都醫(yī)學院生物技術實驗中心。

指示細菌培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基；指示真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.3儀器

旋轉蒸發(fā)儀（SWITZERLAND公司）；SHB-IIIG真空泵：（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；ZHWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器（海智城分析儀器制造有限公司）；SW-GJ-2FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）。

2　方　法

2.1抑菌活性物質(zhì)的制備

采集新鮮紅花酢漿草葉和莖，洗凈，50℃烘箱內(nèi)烘干。經(jīng)打粉機粉碎為≤100目的粉末，4℃避光保存。采用冷浸法提取紅花酢漿草的抑菌活性物質(zhì)[15]：稱取粉末4 g，裝入250 mL三角瓶，按照1∶50 g/mL加入50%的乙醇200mL，室溫靜置2d。布氏漏斗真空抽濾，收集濾液，將濾液轉移到蒸餾燒瓶中蒸餾濃縮。蒸餾溫度為50℃，濃縮到10mL，45 μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃冰箱避光保存。

2.2抑菌活性檢測

采用管碟法檢測提取液的體外抑菌活性。指示菌選用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌沙門氏桿菌，將OD600在2.2～2.4的菌液稀釋100倍，每個LB平板加130μL稀釋菌液，涂布均勻。每個平板放3個牛津杯，每個平板設置3個平行組，每個牛津杯中加入提取液200 μL，4℃冰箱放置4 h后，37℃過夜培養(yǎng)，最后檢測抑菌圈直徑。

2.3單因素實驗

以抑菌直徑為考核指標，對乙醇濃度、提取時間、提取溫度、固液比和提取次數(shù)5個提取條件進行優(yōu)化，各個變量的取值范圍見表1。

表1　5個提取條件的取值范圍

2.4響應面法確定最佳提取工藝

通過單因素實驗，選取提取時間、乙醇體積分數(shù)和固液比這3個主要的提取條件，提取溫度設定為50℃，提取次數(shù)設定為1次。以提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為響應值，進行響應面法的Box-Behnken優(yōu)化設計。以提取溫度、乙醇體積分數(shù)和固液比為變量，通過Design Expect8.0.6進行試驗設計，結果見表2。

3　結　果

3.1抑菌譜測定

由表3可見，紅花酢漿草乙醇提取物不僅抑制巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌等11種細菌，還可以抑制白色念珠菌、土曲霉、綠色木霉等10種真菌的生長，具有較廣的抑菌譜。

表2　響應面分析實驗因素水平表

3.2單因素實驗

3.2.1提取時間對抑菌效果的影響

分別以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌沙門氏桿菌為指示菌，考察提取時間對乙醇提取物抑菌活性的影響。由圖1可知，隨著時間的增加，乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大；當提取時間超過70min后，抑菌圈直徑開始減小。究其原因，可能是提取時間過長，導致有效物質(zhì)的分解失活，最終確定最佳提取時間為70min。

圖1　提取時間對抑菌圈直徑的影響

3.2.2提取溫度對抑菌效果的影響

由圖2可見，隨著提取溫度的增加，乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大。當超過50℃后，繼續(xù)升高溫度，抑菌圈直徑開始降低。這可能是因為溫度過高導致有效物質(zhì)失活，因此確定最佳提取溫度為50℃。

圖2　提取溫度對抑菌圈直徑的影響

3.2.3乙醇體積分數(shù)對抑菌效果的影響

研究發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，紅花酢漿草乙醇提取物的抑菌圈直徑逐漸增大，當乙醇體積分數(shù)達到70%時，達到最大值。而乙醇提取分數(shù)為90%時，提取物抑菌活性下降。這可能是因為乙醇體積分數(shù)過大時水溶性的有效物質(zhì)溶解減少，其他沒有活性的脂溶性物質(zhì)溶解增加，故確定最佳乙醇體積分數(shù)為70%。

圖3　乙醇體積分數(shù)對抑菌圈直徑的影響

3.2.4固液比對抑菌效果的影響

從圖4中可見，對于金黃色葡萄球菌而言，固液比從1∶5增加到1∶15后抑菌圈直徑增大，但繼續(xù)增大固液比后，抑菌圈直徑變化不大。T檢驗可以看出不同固液比之間沒有顯著性差異。而以沙門氏桿菌作為指示菌時，隨著固液比從1∶5增加到1∶35的過程中，抑菌圈直徑逐漸增大，但繼續(xù)增大固液比后，抑菌圈直徑開始降低。T檢驗可以看出1∶35下的固液比與1∶5、1∶25和1∶45下的抑菌圈直徑之間的P＜0.05，有顯著性差異，存在統(tǒng)計學意義，于是最佳固液比值確定為1∶35。

圖4　固液比對抑菌圈直徑的影響

3.2.5提取次數(shù)對抑菌效果的影響

從圖5中可以看出，對于金黃色葡萄球菌而言，隨著提取次數(shù)從1次變?yōu)?次后，抑菌圈直徑顯著增大，而3次時抑菌圈直徑略微減小，但差異不顯著。當以沙門氏桿菌作為指示菌時，從圖中可以看出隨著提取次數(shù)的增加抑菌圈直徑逐漸增大。但從減少生產(chǎn)能耗的角度，提取次數(shù)確定為1次。

3.3響應面法確定最佳提取工藝

3.3.1Box-Behnken試驗設計及結果

根據(jù)單因素試驗結果，確定影響紅花酢漿草乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的主要因素為提取時間、乙醇體積分數(shù)和固液比。按表2的因素與水平設計一個3因素3水平的優(yōu)化試驗方案，其中中心點為5個，總共17組試驗。

圖5　提取次數(shù)對抑菌圈直徑的影響

3.3.2建立數(shù)學模型

利用Design-Expert.8.0.6軟件對表4中實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得到提取時間、乙醇體積分數(shù)和固液比與抑菌直徑的二次多元回歸方程：

3.3.3方差分析

對表3中的實驗結果進行統(tǒng)計學分析，得到的方差分析結果如表4所示。F檢驗（P=0.0009）證明回歸方程在統(tǒng)計學上是顯著的，相關系數(shù)r2=0.9520，說明響應面95.20%的變化可以用該模型來解釋。只有0.08%的改變不能通過該模型擬合得到，可能是噪點的干擾?；貧w方程系數(shù)顯著性結果見表5。X3（P=0.044 8）、X1和X2的交互作用（P=0.020 6）、X1的二次項（P=0.003 6）、X2的二次項（P<0.001)、X3的二次項（P=0.0119）對抑菌圈的直徑影響顯著。X1、X2、X1和X3的交互作用、X2和X3的交互作用對抑菌圈直徑?jīng)]有顯著性影響。

表3　Box-Behnken試驗設計及結果

表4　響應面二次模型方差分析表

表5　回歸方程系數(shù)顯著性結果

3.3.4響應曲面分析

應用Design-Expert.8.0.6軟件繪制響應曲面圖，可直觀反映各因素對響應值影響的變化趨勢，圖示表明在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應值出現(xiàn)。如圖6所示，在本試驗水平范圍內(nèi)，當固液比處于中心水平（C=0）時，提取時間和乙醇體積分數(shù)交互影響紅花酢漿草抑菌物質(zhì)提取的曲面圖和等高線圖，由等高線的形狀可以看出兩因素的交互作用顯著（橢圓形代表兩因素交互作用顯著）。

如圖7所示，在本試驗水平范圍內(nèi)，當乙醇體積分數(shù)處于中心水平（B=0）時，提取時間和固液比不同水平上的變化，引起響應值的變化不顯著，所以提取時間和固液比的交互作用不明顯。

如圖8所示，在本試驗水平范圍內(nèi)，當提取時間處于中心水平（A=0）時，隨著固液比和乙醇體積分數(shù)的改變，響應值抑菌圈直徑變化不大，所以說乙醇體積分數(shù)和固液比的交互作用不明顯。

圖6　提取時間和乙醇體積分數(shù)交互作用等高線圖

圖7　提取時間和固液比交互作用等高線圖

圖8　乙醇體積分數(shù)和固液比交互作用等高線圖

3.3.5最大抑菌直徑和最佳提取條件的確定

應用Design-Expert8.0.6軟件預測的理想結果為：提取時間為77.81 min，固液比為1∶31.37，乙醇體積分數(shù)為72.52%；此時，獲得的抑菌圈直徑可達30.21mm，如圖9所示。為了便于試驗，提取時間定為78 min，固液比采用1∶31 g/mL，乙醇體積分數(shù)定為73%（見表6）。用以上最佳提取條件重復實驗3次，抑菌圈直徑為30.25，30.16，30.11mm，平均值為30.17mm，與預測值有很好的擬合性，證明了模型的可行性。

表6　模型最佳條件的驗證

4　結束語

通過單因素實驗和響應面法Box-Behnken分析建立了紅花酢漿草抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝：提取時間78 min，固液比1∶31 g/mL，乙醇體積分數(shù)73%，此時獲得的抑制金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大值為30.17mm，較優(yōu)化之前提高了67.61%（優(yōu)化前后的抑菌圈直徑對比如圖10所示）。由此可見，本文利用響應面法建立數(shù)學模型可靠性強，能準確預測抑菌圈的直徑，這為下一步的抑菌活性物質(zhì)的分離、純化，抑菌作用機制研究提供理論依據(jù)。

圖9　響應面模擬最大抑菌圈直徑

圖10　優(yōu)化前后的抑菌圈直徑

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（編輯：莫婕）

Extraction process optimization of antibacterial active substance from Oxalis corymbosa by response surface method

ZHANG Yufeng1，ZHANG Jinhua1，HUANG Yao1，LI Kaixiu1，Yang Li’na2，WANG Dan1
（1.Department of Biomedicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）

An optimum process is designed for extracting antibacterial active substance from Oxalis corymbosa.The extraction time，ethanolconcentration and solid-liquid ratioareselectedas independent variables based on single factor experiment and the diameter of the inhibition zone is considered as response value.After that，a mathematical model is established to calculate and verify the optimal extraction conditions and the theoretically maximum inhibition zone.The optimum extraction process is shown as follows：73%ethanol concentration，78min extraction time，1∶31g/mL solid-liquid ratio.Under these conditions，the maximum antibacterial diameter is 30.17 mm，which hasbeenincreasedby67.61%afteroptimization.Theresponsesurfaceoptimizationmethod introduced in this paper is not only efficient but also reliable；with it，the inhibition zone diameter has been accurately predicted.Besides，the alcohol extract of Oxalis corymbosa has been proved to have a wide range of antibacterial spectra.

Oxalis corymbosa；antimicrobial activity；response surface method；antibacterial spectrum；extraction process

A

1674-5124（2016）03-0053-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.013

2015-10-18；

2015-11-23

四川省教育廳重點項目（16ZA087）；國家級大學生創(chuàng)新訓練項目（201513705006）；中國科學院環(huán)境與應用微生物重點實驗室開放基金項目（KLCAS-2014-04）

張玉楓（1993-），男，四川宜賓市人，專業(yè)方向為生物技術。

王丹（1977-），女，遼寧遼陽市人，副教授，博士，主要從事生物制藥相關方向的研究。