穆懷志，林　琳，于建國(guó)，姜效龍，張　驍，夏富才

(1.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林　132013；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院寒溫帶林業(yè)研究中心，黑龍江 哈爾濱　150086；3.國(guó)家林業(yè)局哈爾濱林業(yè)機(jī)械研究所，黑龍江 哈爾濱　150086；4.吉林市龍?zhí)秴^(qū)新山苗木專(zhuān)業(yè)合作社，吉林 吉林　132206；5.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院，吉林 長(zhǎng)春　130022)

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NaHCO3脅迫下白樺四倍體表型及生理分析

穆懷志1，林琳2，3，于建國(guó)4，姜效龍4，張驍5，夏富才1

(1.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林132013；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院寒溫帶林業(yè)研究中心，黑龍江 哈爾濱150086；3.國(guó)家林業(yè)局哈爾濱林業(yè)機(jī)械研究所，黑龍江 哈爾濱150086；4.吉林市龍?zhí)秴^(qū)新山苗木專(zhuān)業(yè)合作社，吉林 吉林132206；5.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院，吉林 長(zhǎng)春130022)

采用NaHCO3脅迫處理白樺四倍體苗木，測(cè)定其表型特征及生理特性.結(jié)果表明：在NaHCO3脅迫下，白樺四倍體葉片受鹽害程度明顯低于二倍體，苗高和地徑生長(zhǎng)明顯高于二倍體；白樺四倍體凈光合速率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和過(guò)氧化物酶活性始終顯著高于二倍體.

白樺；四倍體；脅迫響應(yīng)

【引用格式】穆懷志，林琳，于建國(guó)，等．NaHCO3脅迫下白樺四倍體表型及生理分析[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，17(5)：585-589.

土壤鹽堿化是影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問(wèn)題.全球鹽堿地面積占陸地總面積的1/3以上，并且呈逐年增加的趨勢(shì)[1].如何利用大面積鹽堿地發(fā)展農(nóng)林業(yè)，是國(guó)際上迫切需要解決的重大課題.進(jìn)行鹽堿地改良日益受到淡水資源短缺的限制，而培育耐鹽新品種是開(kāi)發(fā)和利用鹽堿地的有效途徑.采用傳統(tǒng)方法培育耐鹽新品種雖然簡(jiǎn)便可行，但進(jìn)展緩慢，至今尚未培育出真正的耐鹽品種.隨著育種技術(shù)的發(fā)展，人們希望利用新技術(shù)迅速培育出具有一定耐鹽性的植物新品種，為鹽堿地區(qū)的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)服務(wù).

多倍化是植物進(jìn)化歷史中的普遍現(xiàn)象.從植物地理分布上看，多倍體大多出現(xiàn)在高緯度、高海拔等氣候環(huán)境變化劇烈地區(qū)，說(shuō)明植物多倍體比二倍體具有更強(qiáng)的適應(yīng)不利自然條件的能力[2].目前，在木本植物中，以楊樹(shù)(Populus)和刺槐(Robinia)多倍體抗逆育種的成效最為顯著，培育出的多倍體品種與二倍體相比，表現(xiàn)出抗旱、耐鹽、抗病等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上早已推廣應(yīng)用[3-6].

樺木屬(Betula)植物作為分布廣泛的重要用材樹(shù)種[7]，其倍性育種研究始于20世紀(jì)40年代[8]，培育出的歐洲白樺(B.verrucosa)與毛樺(B.pubescens)雜種三倍體在抗病性上顯著優(yōu)于二倍體[9].此后，就再未見(jiàn)到樺木多倍體用于生產(chǎn)的報(bào)道.作者在2012年采用Solexa技術(shù)測(cè)定白樺四倍體和二倍體轉(zhuǎn)錄組時(shí)發(fā)現(xiàn)，白樺四倍體在脅迫響應(yīng)方面與二倍體存在顯著差異，這些差異暗示白樺四倍體的抗逆性可能強(qiáng)于白樺二倍體[10].針對(duì)這一問(wèn)題，我們對(duì)來(lái)源于同一家系的白樺四倍體和二倍體進(jìn)行NaHCO3脅迫，通過(guò)對(duì)苗木表型特征和生理特性的研究，分析白樺四倍體與白樺二倍體的耐鹽性是否存在顯著差異，以期為通過(guò)倍性育種創(chuàng)造材質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)、高產(chǎn)等優(yōu)良性狀為一體的白樺良種提供參考.

1　材料及方法

1.1供試材料

用秋水仙素處理來(lái)自同一家系的白樺種子，同時(shí)設(shè)置非處理水對(duì)照.將萌發(fā)的種子在育苗杯中育苗后進(jìn)行倍性鑒定[11]，分別獲得白樺四倍體76株和二倍體70株，將這些苗木移栽到直徑15cm、高20cm的塑料花盆中進(jìn)行常規(guī)水肥管理.分別隨機(jī)選取白樺四倍體和二倍體各20株進(jìn)行0.8%NaHCO3脅迫處理，每3d脅迫1次，每次用2L溶液.

1.2鹽害指數(shù)及相對(duì)生長(zhǎng)量測(cè)定

NaHCO3脅迫12d后，調(diào)查苗木葉片的鹽害指數(shù).其中，無(wú)鹽害現(xiàn)象為0級(jí)；輕度鹽害(葉片邊緣變黃或有少量黃點(diǎn))為1級(jí)；中度鹽害(葉片約1/2面積出現(xiàn)枯黃)為2級(jí)；重度鹽害(葉片約3/4面積出現(xiàn)枯黃)為3級(jí)；極重度鹽害(葉片全部變黃、焦枯或脫落)為4級(jí).鹽害指數(shù) = ∑(鹽害級(jí)值 × 相應(yīng)鹽害級(jí)值的葉片數(shù)量)/總?cè)~片數(shù)量[12].

脅迫前，測(cè)定白樺四倍體和二倍體的苗高和地徑，并記為基值.脅迫處理后進(jìn)行正常水肥管理.苗木停止生長(zhǎng)后，再次測(cè)定白樺四倍體和二倍體的苗高和地徑，并記為終值.相對(duì)生長(zhǎng)量 =(終值-基值)/基值 × 100%[13].同時(shí)測(cè)定非脅迫條件下白樺四倍體和二倍體苗高及地徑的相對(duì)生長(zhǎng)量.

1.3光合作用測(cè)定

分別于NaHCO3脅迫0，3，6，9和12d選取每株白樺四倍體和二倍體頂端第3片葉片，利用光合儀(LI-6400，LI-COR，USA)在光強(qiáng)1 000μmol/(m2·s)、CO2濃度400μmol/mol、葉片溫度30 ℃條件下分別測(cè)定凈光合速率和蒸騰速率，計(jì)算水分利用率：水分利用率=凈光合速率/蒸騰速率[14].

1.4生理指標(biāo)測(cè)定

摘取測(cè)定光合作用的葉片于液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，利用分光光度計(jì)(722，TP，China)分別測(cè)定白樺四倍體和二倍體在NaHCO3脅迫下0，3，6，9和12d的可溶性糖含量[15]、可溶性蛋白含量[15]、脯氨酸含量[16]、丙二醛含量[17]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[18]和過(guò)氧化物酶(POD)活性[19].

2　結(jié)果與分析

2.1鹽害指數(shù)與相對(duì)生長(zhǎng)量

NaHCO3脅迫后，有的白樺四倍體和二倍體葉片出現(xiàn)變黃、焦枯和脫落現(xiàn)象，白樺四倍體的葉片鹽害指數(shù)顯著低于白樺二倍體，僅為1.58，比二倍體低31.15%(圖1).苗木停止生長(zhǎng)后，分別測(cè)定非脅迫和脅迫條件下白樺四倍體和二倍體苗高及地徑的相對(duì)生長(zhǎng)量.結(jié)果表明：在非脅迫條件下，白樺四倍體苗高和地徑的相對(duì)生長(zhǎng)量分別比二倍體低34.80%和2.80%(圖2a)；在NaHCO3脅迫條件下，白樺四倍體苗高和地徑的相對(duì)生長(zhǎng)量明顯高于二倍體，達(dá)到20.19%和18.44%，分別比二倍體高41.29%和106.26%(圖2b).以上結(jié)果說(shuō)明：在NaHCO3脅迫下，白樺四倍體的葉片受鹽害程度明顯低于二倍體，苗高和地徑生長(zhǎng)明顯高于二倍體，苗木整體呈現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性.

2.2光合作用

測(cè)定NaHCO3脅迫過(guò)程中白樺四倍體和二倍體的葉片凈光合速率和蒸騰速率，計(jì)算水分利用率，見(jiàn)圖3.結(jié)果表明：隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，白樺四倍體和二倍體的凈光合速率和蒸騰速率呈下降趨勢(shì)，水分利用率呈上升趨勢(shì).在凈光合速率方面，脅迫前四倍體的凈光合速率達(dá)到19.87μmol/(m2·s)，比二倍體高29.53%.脅迫12d后，四倍體的凈光合速率雖降至10.09μmol/(m2·s)，但仍比二倍體高20.55%；在蒸騰速率方面，脅迫前四倍體的蒸騰速率為6.24mmol/(m2·s)，比二倍體高19.77%，脅迫后降至1.78mmol/(m2·s)，與二倍體差異不顯著；在水分利用率方面，脅迫前四倍體的水分利用率為2.80mmol/mol，與二倍體差異不顯著，脅迫后升至5.78mmol/mol，比二倍體高12.45%.

2.3主要生理指標(biāo)

測(cè)定NaHCO3脅迫過(guò)程中白樺四倍體和二倍體的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、SOD活性和POD活性，見(jiàn)圖4.結(jié)果表明：在可溶性糖和可溶性蛋白含量方面，四倍體和二倍體均呈下降趨勢(shì)，且四倍體始終高于二倍體.脅迫前四倍體的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.10mg/g和2.62mg/g，比二倍體高94.19%和36.28%，脅迫后雖然均有所下降，但仍比二倍體高123.70%和133.93%；在丙二醛含量方面，四倍體和二倍體均呈上升趨勢(shì)，脅迫前四倍體和二倍體的丙二醛含量差異不顯著，脅迫后四倍體的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度升至9.06μmol/g，比二倍體低36.64%；在脯氨酸含量、SOD活性和POD活性方面，四倍體和二倍體均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且四倍體始終高于二倍體.其中，四倍體在脅迫第9天時(shí)的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性和POD活性達(dá)到最大，分別為17.59μg/g，20.66U/g和15.79U/g，比二倍體高114.51%，39.69%和90.01%.

3　結(jié)論與討論

植物多倍體的特點(diǎn)不僅體現(xiàn)在提高生長(zhǎng)速度和增加代謝產(chǎn)物上，在抗旱、耐鹽、抗病等方面，多倍體與二倍體相比也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì).美洲白樺五倍體與二倍體相比具有較強(qiáng)的抗旱性[20]，歐洲白樺與毛樺的雜種三倍體在抗病性上顯著優(yōu)于二倍體[9].本次研究通過(guò)NaHCO3脅迫白樺四倍體發(fā)現(xiàn)：與二倍體相比，白樺四倍體的受鹽害程度明顯降低，苗高和地徑的相對(duì)生長(zhǎng)量明顯升高，苗木整體呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽性.

光合作用是植物體內(nèi)極為重要的代謝過(guò)程，它的強(qiáng)弱對(duì)于植物生長(zhǎng)、生殖和抗逆性均有十分重要的影響[21].有研究表明，在非脅迫條件下，白樺四倍體的光合作用與二倍體存在明顯差異，其最大凈光合速率、光飽和點(diǎn)和羧化效率分別比二倍體高24.81%，9.41%和25.19%[22].本項(xiàng)研究結(jié)果表明：在NaHCO3脅迫下，雖然白樺四倍體的凈光合速率有所下降，但仍始終高于二倍體；水分利用率的不斷上升，也說(shuō)明白樺四倍體對(duì)于鹽脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，該結(jié)果與美洲白樺多倍體的研究結(jié)果大致相同[20].

活性氧是氧化能力很強(qiáng)的幾種含氧物質(zhì)的總稱(chēng)，當(dāng)植物遭遇逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞中活性氧積累及其過(guò)氧化作用被認(rèn)為是脅迫傷害的一個(gè)重要機(jī)制[23].作為主要的抗氧化酶，SOD和POD擔(dān)負(fù)著淬滅活性氧的任務(wù)，這些保護(hù)酶的水平與植物的抗鹽性有很大關(guān)系[24-25].此外，鹽漬條件下的植物要受到滲透脅迫的傷害，若要減輕或避免這種傷害，植物需要在細(xì)胞中積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)劑進(jìn)行調(diào)節(jié)[26].本次研究發(fā)現(xiàn)：在NaHCO3脅迫過(guò)程中，白樺四倍體的脯氨酸含量、SOD活性和POD活性在9d之前均呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，說(shuō)明這些物質(zhì)在四倍體對(duì)抗鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮了作用；9d以后，脯氨酸含量、SOD活性和POD活性均有所下降，可能是由于脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脯氨酸和抗氧化酶的合成系統(tǒng)受到破壞引起的.另外，在脅迫過(guò)程中，白樺四倍體的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、SOD活性和POD活性始終高于二倍體，且四倍體脯氨酸含量和POD活性持續(xù)上升的時(shí)間比二倍體長(zhǎng)3d，這些都是造成白樺四倍體抗鹽性增強(qiáng)的原因.

有研究表明，白樺四倍體在刺激響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、植物與病原體相互作用等方面的基因表達(dá)與二倍體存在顯著差異[10].因此，下一步要對(duì)白樺四倍體與抗逆相關(guān)的基因進(jìn)行克隆和功能驗(yàn)證，為揭示其抗逆機(jī)理提供資料，從而更加準(zhǔn)確、全面地反映白樺四倍體的抗逆性.

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【責(zé)任編輯：郭偉】

Morphology and Physiology of Autotetraploid Betula platyphyllaRespondingtoNaHCO3Stress

Mu Huaizhi1，Lin Lin2，3，Yu Jianguo4，Jiang Xiaolong4，Zhang Xiao5，Xia Fucai1

(1.Forestry College of Beihua University，Jilin 132013，China；2.Research Center of Cold Temperate Forestry，Chinese Academy of Forestry，Harbin 150086，China；3.Harbin Research Institute of Forestry Machinery，China State Forestry Administration，Harbin 150086，China；4.Xinshan Nursery Stock Cooperative of Longtan District of Jilin City，Jilin 132206，China；5.Forest Survey and Design Institute of Jilin Province，Changchun 130022，China)

ToevaluatetheimpactofintraspeciesgenomeduplicationonNaHCO3stress，aseriesofBetula platyphyllaautotetraploidsanddiploidsweregeneratedfromthesamefamily.Themorphologyandphysiologyoftheseautotetraploidindividualswerecomparedwiththosediploidtrees.Autotetraploidsweresuperiorininjuryindexandrelativegrowthofheightandbasediametercomparedtodiploids.Physiologicaldatarevealedautotetraploidsweregenerallyhigherexpressioninnetphotosyntheticrate，solublesugarcontent，solubleproteincontent，prolinecontent，superoxidedismutaseactivityandperoxidaseactivity.

Betula platyphylla；autotetraploid；stressresponse

1009-4822(2016)05-0585-05

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.006

2016-04-25

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015139)；北華大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金.

穆懷志(1985-)，男，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail:huaizhimu@126.com；

夏富才(1973-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物學(xué)研究，E-mail:xfc0707@163.com．

S722.35

A