劉 麗， 劉 磊， 趙 芮， 韋 寧， 楊 琳，劉仁沿， 梁玉波*， 孫 茜

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧大連116023)

大田軟海綿酸(Okadaic Acid，OA)及其天然衍生物鰭藻毒素(Dinophysistoxins，DTXs)是腹瀉性貝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)的致腹瀉性成分。這些毒素是以O(shè)A為骨架結(jié)構(gòu)的天然同系物[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。此類毒素可以通過食物鏈的傳遞，在貝類體內(nèi)累積。食用者誤食了染毒貝類后，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等中毒癥狀。此類毒素還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡和腫瘤的形成[2,3]。OA和DTXS是分布范圍最廣、發(fā)病率最高的海洋生物毒素之一，眾多的沿海國(guó)家或地區(qū)都已發(fā)現(xiàn)和檢出了這類毒素[4]。歐盟規(guī)定雙殼貝類中OA及其等價(jià)物毒素的安全劑量為160 μg/kg貝肉[5]。

圖1 OA和DTXs 毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of okadaic acid and dinophysistoxins OA:R1=CH3,R2=H;DTX1:R1=CH3,R2=CH3;DTX2:R1=H,R2=CH3.

目前，針對(duì)DSP的檢測(cè)方法主要有小鼠生物法[6]、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)法[7]、磷酸酶活性抑制檢測(cè)法[8]和酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)[9]等。ELISA法是利用抗體抗原的特異性結(jié)合，通過加入酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記的二抗，經(jīng)底物顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定的免疫化學(xué)方法，操作簡(jiǎn)單方便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，檢測(cè)時(shí)間短，分析速度快，適于大量樣本的快速篩查。目前，國(guó)外已有可用于藻類和貝類樣品中OA和DTX1檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析商品化試劑盒，國(guó)內(nèi)對(duì)此類毒素試劑盒的開發(fā)也有研究報(bào)道，但只是針對(duì)OA的檢測(cè)[10 - 12]，而對(duì)DTXs檢測(cè)尚未見研究報(bào)道。本課題組曾制備了抗OA的單克隆抗體[13]，并建立了相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法。本文利用抗OA的單克隆重抗體，研究測(cè)試了該抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品OA、DTX1和DTX2的競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)，并嘗試?yán)迷摽贵w建立檢測(cè)DTX1和DTX2的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)方法，以期為我國(guó)DTX1和DTX2的快速檢測(cè)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)，BIO-RAD公司)；Wellwash AC型洗板機(jī)(美國(guó)，Thermo Fisher)；L535-1型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；IKA MS2 Minishaher型渦旋混合器(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；WZ-2A型微量振蕩器(北京海淀電子醫(yī)療儀器廠)；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Starter2100型酸度計(jì)(OHRUS)。

1.2 試劑與材料

OA、DTX1和DTX2標(biāo)準(zhǔn)品，均購自加拿大海洋生物研究所：OA-OVA(Okadaic Acid-ovalbumin，OA-OVA)偶聯(lián)抗原和單克隆抗體均為本課題組自行研制[12]；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L) 購自Thermo公司；二甲基亞砜(DMSO)、聚乙烯醇(PVA)，均購自Sigma 公司；碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)、洗液PBS -T (pH=7.4)、顯色液均為本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

生物樣品于2014年春季采自東海上海附近海域，包括蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、扁玉螺(Neveritadidyma)和螠蟶(Sinonovaculaconstricta)。蝦夷扇貝去殼去消化腺勻漿，扁玉螺和螠蟶去殼勻漿。稱取2 g組織勻漿，加入9 mL甲醇，渦旋3 min混勻，超聲提取10 min，3 500 r/min離心10 min，傾倒出上清液，重新提取一次，合并兩次提取液，用甲醇定容至20 mL。然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)將樣品稀釋30倍，待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。用OA-OVA 偶聯(lián)物作為包被抗原，用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)稀釋2 000倍后，加到96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃過夜；棄去殘液，洗滌96 孔酶標(biāo)板，洗液為PBS -1%吐溫-20洗滌3次；用 1%的 PVA-PBS溶液每孔300 μL封閉，37 ℃孵育3 h(可保存數(shù)周)。測(cè)定時(shí)棄去封閉液，洗板3次，每孔加OA、DTX1和DTX2標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品各50 μL，及適當(dāng)稀釋的單抗50 μL，振蕩90 s，37 ℃孵育1 h；洗滌3次，加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠，每孔100 μL，37 ℃孵育40 min；洗板，每孔加TMB底物溶液100 μL，37 ℃避光顯色12 min后中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 OA、DTX1和DTX2的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以加入不同濃度的OA、DTX1和DTX2標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值與空白對(duì)照孔吸光度值的比(抑制率，B/B0)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的OA、DTX1、DTX2標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)物抑制率為50%時(shí)所需的質(zhì)量濃度即Ic50。結(jié)果表明：OA在0.13～10.00 μg/L范圍內(nèi)，B/B0值(y)與其濃度的對(duì)數(shù)值(x)呈線性關(guān)系，回歸方程為:y=-0.4475x+0.6616，r=0.9862，Ic50=2.30 μg/L。DTX1在0.32～10.00 μg/L范圍內(nèi)，B/B0值(y)與其濃度的對(duì)數(shù)值(x)呈線性關(guān)系，回歸方程為:y=-0.5037x+0.821，r=0.9796，Ic50=4.34 μg/L。DTX2在0.32～10.00 μg/L范圍內(nèi)，B/B0值(y)與其濃度的對(duì)數(shù)值(x)呈線性關(guān)系，回歸方程為:y=-0.5697x+0.7636，r=0.9824，Ic50=2.90 μg/L。

以PBS(pH=7.4)做10個(gè)空白對(duì)照，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)出 10個(gè)空白對(duì)照孔OD值的平均值為0.988，10個(gè)OD值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.014。以空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍計(jì)算檢出限，所建立ELISA法分析OA的檢出限為0.22 μg/L，相當(dāng)于65 μg/kg貝肉；DTX1的檢出限為0.53 μg/L，相當(dāng)于159 μg/kg貝肉；DTX2的檢出限為0.45 μg/L，相當(dāng)于135 μg/kg貝肉，完全能夠滿足規(guī)定的160 μg/kg的安全閾值要求。

2.2 OA、DTX1和DTX2的交叉抑制反應(yīng)曲線

圖2 OA、DTX1和DTX2的交叉抑制反應(yīng)曲線Fig.2 Cross inhibition curve of OA,DTX1 and DTX2

用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)孔中的OA、DTX1和DTX2對(duì)包被抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)，以O(shè)A、DTX1和DTX2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制交叉抑制反應(yīng)曲線(圖2)。從圖中可以看出，該抗體對(duì)OA反應(yīng)特異性最強(qiáng)，其次是DTX2，同樣濃度的抗原DTX1對(duì)抗體的反應(yīng)率稍低于DTX2和OA。DTX1、DTX2和OA三種抗原的Ic50分別為4.34 μg/L、2.90 μg/L和2.30 μg/L。Ic50是反應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)性質(zhì)的一個(gè)指標(biāo)，OA的Ic50最小，則表現(xiàn)為該抗體對(duì)OA反應(yīng)特異性最強(qiáng)。

2.3 精確度測(cè)定

進(jìn)行批內(nèi)精確度試驗(yàn)時(shí)，測(cè)定4次標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度抑制率的平均值，并求標(biāo)準(zhǔn)差，按變異系數(shù)公式求出批內(nèi)變異系數(shù)。OA(0.25、2、8 μg/L)，DTX1和DTX2(0.625、2.5、10 μg/L)低、中、高濃度組的批內(nèi)平均變異系數(shù)為6.21%、6.18%、5.11%。進(jìn)行批間精確度試驗(yàn)時(shí)，求標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度在不同批次測(cè)定的抑制率的平均值，并求標(biāo)準(zhǔn)差，按變異系數(shù)公式求出批間變異系數(shù)，OA、DTX1和DTX2低、中、高濃度組的批間平均變異系數(shù)為6.40%、7.28%、5.79%。結(jié)果見表1。

表1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)和批間誤差

2.4 準(zhǔn)確度的測(cè)定

在陰性樣品中加入一定量的OA、DTX1和DTX2標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成低濃度組樣品，OA的最終濃度均為1 ng/mL，DTX1和DTX2最終濃度均為2.5 ng/mL。高濃度組樣品OA、DTX1和DTX2的最終濃度均為8 ng/mL。用上述ELISA 法檢測(cè)樣品的吸光度值，測(cè)定后計(jì)算抑制率，代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出毒素的質(zhì)量濃度值，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 樣品回收率結(jié)果

此方法OA、DTX1和DTX2的低、高濃度組的平均回收率為84.3%、76.4%、79.9%。說明該方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本文利用研制的抗OA的單克隆抗體，建立了靈敏的競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)OA、DTX1和DTX2的方法，可以快速篩選出陽性樣品，能廣泛應(yīng)用于OA、DTX1和DTX2同時(shí)快速檢測(cè)分析，為大規(guī)模開展實(shí)施我國(guó)赤潮微藻毒素監(jiān)測(cè)計(jì)劃，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，以及人們的健康奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，且具有廣闊的應(yīng)用前景。