孫照霞， 蘇 慧， 叢日琳,2， 徐 偉， 褚克丹， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122;2.榮成市中醫(yī)院，山東威海 264300)

橙皮苷(Hesperidin)和柚皮苷(Naringin)均屬于黃酮類化合物，在C-2位存在手性中心，具有旋光性，廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物的果肉和果皮中，在臨床上具有抗炎[1]、抗癌[2]、抗氧化[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、改善糖尿病[5]等多種生理活性，具有較高的藥用價值。目前，文獻(xiàn)報道橙皮苷或柚皮苷對映體拆分方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6,7]和毛細(xì)管電泳法(CE)[8 - 13]。相較于HPLC，CE具有分離能力強(qiáng)，快速，樣品、溶劑和手性選擇劑用量少，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，可選擇和改變的手性選擇劑種類多等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于手性拆分。采用環(huán)糊精修飾手性毛細(xì)管膠束電動色譜法(CD-MEKC)，如CE中添加環(huán)糊精和膽酸鹽雙手性選擇劑，可提高CE手性拆分能力[14,15]。但未見利用CD-MEKC同時分離檢測橙皮苷和柚皮苷對映體的報道。

本文采用羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD修飾手性膠束毛細(xì)管電動色譜法同時分離檢測橙皮苷和柚皮苷對映體。在優(yōu)化分離條件下，橙皮苷和柚皮苷對映體在9 min內(nèi)得到完全分離，將該方法應(yīng)用于中藥制劑胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對映體的測定，回收率為86.0%～113.2%。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國，Beckman Coulter公司)，附二極管陳列檢測器(DAD)；未涂層熔融石英毛細(xì)管(63.5 cm×75 μm i.d.,有效長度52 cm，美國Beckman coulter公司)；雷磁pHS-3C型精密酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；XS105電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110721-201014，中國藥品生物制品檢定所)；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號：110722-200309，中國藥品生物制品檢定所)。膽酸鈉(SC，北京百靈威科技有限公司)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，美國 SIGMA-ALDRICH)；硼砂、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為分析純，所用水為Milli-Q超純水。

胃蘇顆粒(批號：12031101，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))。

1.2 對照品及供試品溶液配制

精密稱取橙皮苷和柚皮苷的對照品，分別用甲醇溶解配成濃度為1 mg/mL的溶液，冷藏備用，使用時用超純水稀釋成所需濃度即可。精密稱取研細(xì)的胃蘇顆粒藥品粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，用20 mL甲醇超聲提取30 min，靜置，過濾，殘渣同法再操作一次，合并兩次濾液，水浴濃縮至3～4 mL，甲醇定容至10 mL。使用前均需用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3 實驗方法

未使用過的毛細(xì)管分別用1 mol/L的HCl，超純水，1 mol/L的NaOH溶液，超純水，運(yùn)行緩沖液各沖洗20 min。使用過的毛細(xì)管分別用超純水，0.1 mol/L的NaOH，超純水，運(yùn)行緩沖液各沖洗5 min即可。兩次進(jìn)樣間用運(yùn)行緩沖液沖洗2 min。所有溶液在電泳前均需用0.22 μm聚乙烯濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離檢測條件的優(yōu)化

圖1 HP-β -CD濃度對橙皮苷和柚皮苷對映體拆分的影響Fig.1 Effect of HP-β -CD concentration on the chiral separation of hesperidin and naringin Running buffer:10 mmol/L NaB4O7+60 mmol/L SC+different concentrations of HP-β -CD:(a)20 mmol/L;(b)25 mmol/L;(c)30 mmol/L;(d)35 mmol/L;separation voltage:25 kV;hydrodynamic injection:0.5 psi×4s;detection wavelength:214 nm;temperature:25 ℃.1,1′:Hesperidin;2,2′:Naringin.

2.1.1手性選擇劑的選擇及濃度優(yōu)化實驗考察了α，β，γ-環(huán)糊精及其衍生物HP-β-CD和SC手性膠束對橙皮苷和柚皮苷對映體拆分效果的影響。實驗發(fā)現(xiàn)HP-β-CD對橙皮苷對映體拆分效果最佳，且可達(dá)到基線分離；SC手性膠束對柚皮苷對映體拆分效果最佳，但單獨(dú)使用它們均無法實現(xiàn)同時拆分橙皮苷和柚皮苷對映體。進(jìn)一步考察了采用HP-β-CD和SC膠束雙手性選擇劑對橙皮苷和柚皮苷對映體拆分效果的影響，實驗結(jié)果表明由于HP-β-CD和SC膠束的協(xié)同作用，橙皮苷和柚皮苷對映體均能得到拆分。

實驗考察雙手性選擇劑濃度對分析物拆分效果的影響?？疾炝薙C濃度為50、55、60、65、70 mmol/L時對分析物拆分效果的影響，結(jié)果表明60 mmol/L SC拆分效果最佳?？疾霩P-β-CD濃度在20～35 mmol/L范圍內(nèi)對拆分效果的影響，結(jié)果如圖1。隨著HP-β-CD濃度的增大，分析時間縮短，柚皮苷對映體的分離度變大，但橙皮苷對映體的分離度變?。划?dāng)濃度大于30 mmol/L時，柚皮苷對映體分離度降低。綜合考慮橙皮苷對映體和柚皮苷對映體的分離情況，選擇30 mmol/L為HP-β-CD最佳濃度。

2.1.2緩沖液pH的優(yōu)化緩沖液pH的大小是影響分離的重要因素之一，pH的變化會影響電滲流的大小，改變手性選擇劑和分析物的帶電情況，進(jìn)而影響其遷移率及分離度。實驗以20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH為背景緩沖液，考察了pH在8.0～9.5范圍內(nèi)對分離的影響。結(jié)果表明，隨著pH的增大，分析物的分離度變大，遷移時間縮短；當(dāng)pH大于9.0時，橙皮苷對映體的分離度變小。綜合考慮分離度及分析時間的影響，選擇20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0)為最佳背景緩沖液。

2.1.3有機(jī)添加劑的選擇有機(jī)添加劑主要的作用是抑制電滲流，延長遷移時間，增加分析物的溶解度，從而改善分離度。為了進(jìn)一步提高其分離度，實驗考察了不同有機(jī)添加劑對分離的影響，分別考察了乙腈、甲醇、異丙醇的影響。實驗結(jié)果表明，當(dāng)加入乙腈或異丙醇時，隨著其濃度的增大，柚皮苷對映體的峰形展寬且分離度下降；而甲醇則可以改善柚皮苷對映體的分離，考察了甲醇在2%～10%(V/V)范圍對其分離的影響，實驗發(fā)現(xiàn)添加3%(V/V)甲醇時，高濃度的柚皮苷對映體亦能得到基線分離。

圖2 橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離譜圖Fig.2 Electropherogram of the standard mixture solution of hesperidin and naringin Running buffer:60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β -CD +20 mmol/L NaH2PO4-100 mM NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)methanol;other conditions as in Fig.1.

2.1.4分離電壓的優(yōu)化實驗考察了在20～26 kV范圍內(nèi)，分離電壓對分離效果的影響。當(dāng)分離電壓低于25 kV時，遷移時間延長，峰形展寬；分離電壓大于25 kV時，柚皮苷對映體不能達(dá)到基線分離。綜合考慮分離度、峰形和分析時間，選擇25 kV為最佳分離電壓。

綜上所述，優(yōu)化條件為：60 mmol/L SC+30 mmol/L HP-β-CD+20 mmol/L NaH2PO4-100 mmol/L NaOH(pH=9.0，97%(V/V))+3%(V/V)甲醇為運(yùn)行緩沖液，分離電壓25 kV。在上述條件下橙皮苷和柚皮苷對映體標(biāo)準(zhǔn)混合液的電泳圖如圖2。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1精密度試驗在上述優(yōu)化的條件下，將一定濃度的橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)液在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計算各對映體的峰面積和遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測得橙皮苷1、橙皮苷1′、柚皮苷2和柚皮苷2′的遷移時間和峰面積的RSD分別為0.43%、0.46%、0.54%、0.57%和3.5%、1.0%、2.7%、3.7%。

2.2.2線性關(guān)系及檢測限在優(yōu)化條件下，對一系列不同濃度的橙皮苷和柚皮苷混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分析測定，以電泳譜圖的峰面積(Y)分別對橙皮苷和柚皮苷對映體濃度(X，μg/mL)進(jìn)行回歸分析；由于橙皮苷和柚皮苷為消旋體，故其異構(gòu)體濃度可視為其濃度的1/2)，并根據(jù)三倍信噪比(S/N=3)確定其檢測限。所得的線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及檢測限如表1所示。

表1 橙皮苷和柚皮苷對映體線性回歸方程和檢測限

圖3 胃蘇顆粒劑提取物的毛細(xì)管電泳分離譜圖Fig.3 Electropherograms of the extract of Weisu granules(a) and the above extract + the accurate amount of analytes(b) The separation conditions as in Fig.2.

2.2.3穩(wěn)定性試驗精密稱定同一批號的胃蘇顆粒粉末，按1.2節(jié)制備供試品溶液，室溫條件下每隔4 h進(jìn)樣測定橙皮苷和柚皮苷對映體的峰面積變化，經(jīng)計算，在24 h內(nèi)各對映體峰面積的RSD均小于5%，說明樣品的穩(wěn)定性較好。

2.3 樣品分析及回收率試驗

取同一批胃蘇顆粒制劑，按1.2節(jié)制備供試品溶液，在最佳電泳條件下，測定樣品中橙皮苷和柚皮苷對映體的含量，結(jié)果如表2所示。實際樣品的毛細(xì)管電泳圖見圖3。為驗證方法的可靠性，對胃蘇顆粒樣品進(jìn)行加入回收率試驗，結(jié)果如表2所示，橙皮苷和柚皮苷對映體的回收率在86.0%～113.2%之間。

表2 胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對映體的含量及回收率試驗結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本文建立了一種同時分離檢測胃蘇顆粒中橙皮苷和柚皮苷對映體的環(huán)糊精修飾毛細(xì)管膠束電動色譜法(CD-MEKC)。實驗發(fā)現(xiàn)單獨(dú)采用一種手性選擇劑如HP-β-CD或SC均無法同時拆分橙皮苷和柚皮苷對映體；而采用雙手性選擇劑，由于HP-β-CD和SC手性膠束的協(xié)同作用，橙皮苷和柚皮苷對映體得到有效分離。所建立的方法簡單快速，分離度好，精密度高，有望為含橙皮苷和柚皮苷對映體的復(fù)雜樣品的定量檢測提供新方法。