夏碧琪， 黃芙珍， 陳祥準(zhǔn)， 程 潔， 沈 燕， 韓 超*

(1.溫州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江溫州 325027；2.溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,浙江溫州 325035)

花青素是自然界中廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于類黃酮化合物，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷[1]。紅葡萄酒中的花青素是從紅色或黑色葡萄果皮中浸提出來的，通常以單葡糖糖苷、雙葡萄糖苷和酰基等衍生物的形式存在[2]。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，花青素具有抗氧化性、防止DNA損壞、抗癌作用、防止心血管和神經(jīng)類疾病等功能[3 - 6]。

高效液相色譜具有通用性強(qiáng)、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已在葡萄酒花青素類物質(zhì)研究中廣泛應(yīng)用[7]。由于花青素極性很強(qiáng)，在普通反相色譜柱上基本不保留，同時(shí)結(jié)構(gòu)相近的花青素具有類似的紫外吸收，導(dǎo)致了在高效液相色譜定量分析上的局限性。親水相互作用色譜(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC) 具有富含多羥基的糖鏈結(jié)構(gòu)的強(qiáng)親水特性，適用于強(qiáng)極性物質(zhì)的分析[8,9]。本研究建立的HILIC-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法，可用于葡萄酒中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍藥素、飛燕草素葡萄糖苷和氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷4種花青素(結(jié)構(gòu)式見圖1)的定性定量分析。為葡萄酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支持。該方法前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高。

圖1 4種花青素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of four anthocyanins

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；API 4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Milli-Q超純水器(美國(guó)，Millipore公司)。

1.2 試劑與材料

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.4%，CAS No.7084-24-4)購(gòu)自百靈威公司，氯化葡萄糖苷芍藥素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.2%，CAS No.6906-39-4)購(gòu)自Sigma公司，飛燕草素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(99.1%，CAS No.6906-38-3)和氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷(純度98.6%，CAS No.7228-78-6)均購(gòu)自Chroma Dex公司。甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)MERCK公司)；乙酸銨為色譜純(美國(guó)Alfa Aesar公司)；其它試劑除特別說明外均為分析純。

葡萄酒樣品來自客戶委托檢測(cè)樣品。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取花青素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前根據(jù)實(shí)際需要，將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至適宜含量，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理與凈化

葡萄酒樣品用甲醇直接稀釋1 000倍，過0.22 μm微孔濾膜后，供HILIC-MS/MS測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱：MERCK ZIC HILIC柱(150×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為20 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～1 min,95%～50%A;1～10 min，50%A;10～20 min,95%A;流速：250 μL/min，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量：10 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：正離子掃描；離子源溫度：450 ℃；電噴霧電壓：4 500 V；霧化氣(GS1) 壓力：344.5 kPa；輔助氣壓力(GS2)：275.6 kPa；氣簾氣壓力：68.9 kPa；碰撞氣CAD壓力：137.8 kPa。監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將標(biāo)準(zhǔn)品配制成500 ng/mL的溶液，通過流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，調(diào)諧質(zhì)譜參數(shù)。使用ESI源在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式、定性和定量離子。結(jié)果表明：在ESI源的正離子模式下，這4種花青素呈現(xiàn)出最佳響應(yīng)，準(zhǔn)分子離子[M+H]+是響應(yīng)強(qiáng)度最高的離子。在確定母離子后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)，使各分析化合物的響應(yīng)最大化。質(zhì)譜參數(shù)及母離子和子離子詳見表1，四種花青素化合物各有一個(gè)子離子，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

表1 四種花青素的保留時(shí)間和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

圖2 4種花青素MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of four anthocyanins Cyanidin-3-O-glucoside(A),Peonidin-3-O-glucoside(B),Delphinidin-3-O-glucoside(C) and Malvidin-3-O-glucoside(D)

為了優(yōu)化色譜分離，分別考察了色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)、Waters X Bridge TM C18柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)、Waters XselectTM HSS T3柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)、MERCK ZIC HILIC柱(150×2.1 mm i.d.,5 μm)對(duì)4種花青素的分離效果。由于花青素極性很強(qiáng)，在前三種反相色譜柱上基本不保留，只有在MERCK ZIC HILIC 色譜柱上有較好的保留和分離效果。為了提高靈敏度，在流動(dòng)相中分別添加甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等溶液[11,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在添加20 mmol/L乙酸銨的流動(dòng)相中各化合物具有最佳響應(yīng)值，可獲得較好的色譜峰形，各化合物的MRM色譜圖見圖2。由圖2可見，四種花青素并沒有完全分離，然而由于電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 模式下可以同時(shí)在不同窗口下檢測(cè)不同化合物，分離不佳對(duì)定量檢測(cè)沒有干擾。

2.3 方法的線性范圍與相關(guān)系數(shù)

在優(yōu)化的條件下，考察了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物、氯化葡萄糖苷芍藥素、飛燕草素葡萄糖苷和氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷4種待測(cè)物的線性范圍。結(jié)果顯示，4種待測(cè)物均在1.0～50.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)均不低于0.9992。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算該方法定量限(LOQ)，4種花青素的定量限在0.05～1.0 ng/mL之間。各化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表2。

表2 樣品中4種花青素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限

2.4 標(biāo)樣和樣品重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和葡萄酒樣品，連續(xù)測(cè)定6次，在上述儀器條件下，保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在2%以內(nèi)。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

取已知矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍藥素、飛燕草素葡萄糖苷、氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷含量分別為0.58、2.21、3.12、22.1 mg/L的葡萄酒樣品，平行6份，然后分別精確加入矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、氯化葡萄糖苷芍藥素、飛燕草素葡萄糖苷、氯化錦葵色素-3-Β-葡糖苷濃度分別為0.5、2.0、2.0、20.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，按照本方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為93.1%～96.7%，RSD不大于5.2%。應(yīng)用本方法對(duì)客戶委托的10個(gè)不同紅葡萄酒樣品進(jìn)行了分析測(cè)定。每一個(gè)樣品均測(cè)定了三個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果列于表3中。結(jié)果顯示，各花青素在不同樣品中的含量情況差異較大，其中氯化錦葵色素-3-O-葡糖苷在各個(gè)樣品中的含量都最高。

表3 紅葡萄酒樣品中四種花青素含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

3 結(jié)論

本文建立了親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定葡萄酒中4種花青素的分析方法。樣品經(jīng)甲醇稀釋后以Merck ZIC HILIC色譜柱(150×2.1 mm,3.5 μm)分離,乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫,目標(biāo)物在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下檢測(cè)，外標(biāo)法定量，方法無需固相萃取凈化、濃縮等復(fù)雜操作步驟，即可得到準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)果。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，可滿足葡萄酒中4種花青素同時(shí)定性定量分析的要求。