陳 璐， 何治柯

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，湖北武漢 430070；2.生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

流感病毒是正黏液病毒科帶有包膜的RNA病毒，它是很容易造成人和其它動(dòng)物患流行性感冒的病原體[1]。根據(jù)病毒表面的血凝素和神經(jīng)氨酸酶這兩種糖蛋白的不同，可以把流感病毒分成16種H型和9種N型[2]。傳統(tǒng)的流感病毒識(shí)別和檢測(cè)方法有三種，分別為細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒法、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)免疫吸附法和抗原-抗體免疫實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離法檢測(cè)流感病毒比較靈敏，但耗時(shí)費(fèi)力[3]。實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)成本比較高[4]?？乖?抗體免疫實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)是靈敏度不高且檢測(cè)成本比較高[5]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便有效、靈敏度高、成本較低的流感病毒檢測(cè)方法。目前已經(jīng)有很多化學(xué)傳感方法用于檢測(cè)流感病毒，比如電化學(xué)免疫法[6]、石英晶體微天平法[7]、表面等離子體共振法[8]、質(zhì)譜法[9]等。雖然這些方法的檢出限可以達(dá)到105～107pfu/mL，但是不能對(duì)流感病毒進(jìn)行高靈敏的分型檢測(cè)。熒光分析法靈敏度高，與常規(guī)熒光分析法相比，同步熒光分析法具有簡(jiǎn)化譜圖、提高選擇性、減少光散射等特點(diǎn)，尤其適合多組分樣品分析[10]。

本文采用同步熒光均相免疫法對(duì)三種流感病毒H1N1、H5N1以及H9N2進(jìn)行了分型和高靈敏檢測(cè)。分別選擇三種帶有活性基團(tuán)及不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料，與H1N1、H5N1以及H9N2的抗體偶聯(lián)作為流感病毒的捕獲探針，再與氧化石墨烯溶液混合。由于氧化石墨烯具有非常高的熒光猝滅效率[11]，三種帶有病毒抗體的熒光染料的熒光被猝滅。當(dāng)加入適量對(duì)應(yīng)抗體的流感病毒亞型時(shí)，由于抗原-抗體免疫反應(yīng)，使得氧化石墨烯遠(yuǎn)離熒光染料，染料的熒光得以回升。通過(guò)回升的熒光發(fā)射波長(zhǎng)位置和熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)流感病毒的定性分型和定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；RF-5301熒光光譜儀(日本，島津公司)；賽多利斯PB-10 pH計(jì)(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；3 K透析袋以及透析所用夾子(仕必純貿(mào)易有限公司Spectrum Laboratories Inc.)。

三種Alexa Fluor不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光染料均購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司。H1N1、H5N1和H9N2病毒及其抗體均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院張萬(wàn)坡副教授課題組提供。實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純，水溶液均采用Milli-Q(Millipore)超純水凈水器純化的超純水配制。

1.2 Alexa Fluor染料標(biāo)記流感病毒抗體

將0.2 mg的流感病毒H1N1抗體與0.5 mg的Alexa Fluor 488用0.5 mL的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)溶解，在25 ℃條件下輕輕搖動(dòng)，反應(yīng)30 min后，靜置過(guò)夜。然后轉(zhuǎn)入3 K透析袋中透析24 h，透析液為0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)。透析完畢后，取出透析袋中溶液于4 °C冰箱保存，以備后續(xù)使用。將此經(jīng)過(guò)純化后的染料和H1N1病毒抗體的偶聯(lián)復(fù)合物命名為F1-Ab1。采用同樣的方法，分別制備H5N1和H9N2抗體與另外2種Alexa Fluor熒光染料的偶聯(lián)復(fù)合物，依次命名為F2-Ab2和F3-Ab3，并利用紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)定，確定偶聯(lián)后各個(gè)抗體的濃度。

1.3 熒光光譜測(cè)定

分別將F1-Ab1、F2-Ab2和F3-Ab3的溶液配制成1 μmol/L作為儲(chǔ)備液備用；將氧化石墨烯(GO)配制成0.3 mg/mL作為儲(chǔ)備液備用。采用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)分別將H1N1、H5N1和H9N2病毒溶液稀釋成一系列濃度后使用。分別取1 μmol/L的F1-Ab1、F2-Ab2和F3-Ab3溶液和不同濃度的GO溶液定容到500 μL，于470 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定同步熒光光譜。不同體積的三種流感病毒亞型溶液分別加入到F-Ab和GO的水溶液中，同樣定容到500 μL，于470 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

圖1 基于熒光染料標(biāo)記的抗體和氧化石墨烯檢測(cè)H1N1、H5N1和H9N2三種流感病毒亞型原理圖Fig.1 Schematic illustration of the F-Ab and GO based H1N1,H5N1 and H9N2 biosensor

如圖1所示，三種流感病毒亞型的抗體和熒光染料的偶聯(lián)物與GO混合在一起時(shí)，由于GO具有很強(qiáng)熒光猝滅能力，熒光染料的熒光被GO猝滅。當(dāng)三種流感病毒加入時(shí)，抗體與病毒相互作用，使得與抗體偶聯(lián)的熒光染料遠(yuǎn)離GO，熒光得以恢復(fù)，通過(guò)恢復(fù)的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)流感病毒亞型的定量檢測(cè)。

2.2 氧化石墨烯對(duì)F-Ab的熒光猝滅

考察了GO對(duì)F1-Ab1的熒光猝滅能力。如圖2a所示，當(dāng)GO的濃度在0～10 ng/mL范圍內(nèi)變化時(shí)，其對(duì)F1-Ab1的熒光猝滅呈線性關(guān)系。而當(dāng)GO的濃度大于70 ng/mL時(shí)，熒光不再猝滅，表明GO已經(jīng)達(dá)到飽和值。同理考察了GO對(duì)F2-Ab2(圖2b)及F3-Ab3(圖2c)的熒光猝滅能力，其線性范圍均為0～10 ng/mL。隨著GO濃度的增大，熒光猝滅能力增強(qiáng)，GO飽和濃度分別為70 ng/mL(F2-Ab2)和40 ng/mL(F3-Ab3)。

圖2 氧化石墨烯對(duì)病毒抗體標(biāo)記的熒光染料熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Changes in the synchronous fluorescence spectra of virus antibody labeled organic dyes with increasing concentration of GO(0,2.4,4.5,5.5,7.5,8.5,10,12,20,30,40,50,60,70 ng/mL) towards F1-Ab1 (2a); 0,3,5,8,10,15,22,30,40,50,60,70 ng/mL GO towards F2-Ab2(2b); 0,2,5,7,10,15,20,30,40 ng/mL GO towards F3-Ab3(2c).Inset:the curve of quenched fluorescence intensity of F-Ab upon increasing concentration of GO,the detection conditions are all in 15 mmol/L PBS buffer with excitation wavelength 470 nm.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1波長(zhǎng)差的選擇考察了同步掃描熒光法中發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)之間的波長(zhǎng)差△λ對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。由于熒光染料Alexa Fluor的斯托克斯位移為20 nm，所以以第一種熒光染料Alexa Fluor 488的同步熒光強(qiáng)度作為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的參照標(biāo)準(zhǔn)，考察了△λ在 5～25 nm之間變化時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。Alexa Fluor 488的同步熒光峰最高值出現(xiàn)在△λ為10 nm時(shí)，因此，實(shí)驗(yàn)選取△λ為10 nm。

2.3.2PBS濃度的選擇考察PBS濃度在5～25 mmol/L之間變化時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)PBS濃度為15 mmol/L時(shí)，Alexa Fluor 488的同步熒光強(qiáng)度最大。實(shí)驗(yàn)選擇PBS濃度為15 mmol/L。

2.3.3NaCl濃度的選擇考察了NaCl溶液濃度在5～30 mmol/L之間變化時(shí)對(duì)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NaCl濃度為15 mmol/L時(shí)，Alexa Fluor 488的同步熒光強(qiáng)度最大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇NaCl濃度為15 mmol/L。

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

圖3 同步熒光法同時(shí)檢測(cè)H1N1(a)、H5N1(b)及H9N2(c)三種流感病毒亞型的熒光光譜圖Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of F-Ab,GO and H1N1(a),H5N1(b) and H9N2(c) with increasing concentration concentration range:(a)1-18 ng/mL;(b) 1-18.5 ng/mL;(c) 1-16 ng/mL.

分別將H1N1、H5N1和H9N2加入到含有F-Ab 和GO的溶液中，H1N1病毒只與F1-Ab1有特異性作用，使得F1-Ab1的熒光得以恢復(fù)；H5N1病毒只與F2-Ab2有特異性作用，使得F2-Ab2的熒光得以恢復(fù)；而H9N2病毒只與F3-Ab3有特異性作用，使得F3-Ab3的熒光得以恢復(fù)，說(shuō)明三種流感病毒亞型的抗體與其相應(yīng)抗原的作用具有很好的特異性。

2.5 線性范圍和檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)H1N1、H5N1和H9N2進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，如圖3。H1N1的線性范圍為1～18 ng/mL，線性方程為：Y=19.74X+5.248(R2=0.9990)，檢出限為0.48 ng/mL；H5N1的線性范圍為1～18.5 ng/mL，線性方程為：Y=20.08X+2.126(R2=0.9991)，檢出限為0.46 ng/mL；H9N2的線性范圍為1～16 ng/mL，線性方程為：Y=20.29X+0.300(R2=0.9980)，檢出限為0.42 ng/mL。

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

選擇了四種對(duì)照病毒：人腸道病毒EV71、柯薩奇B3、痘病毒和偽狂犬病毒，分別加入到流感病毒的檢測(cè)溶液中，測(cè)量其熒光回升強(qiáng)度值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這四種病毒均不會(huì)產(chǎn)生明顯的熒光回升，而三種流感病毒的熒光回升值非常明顯，說(shuō)明其它病毒對(duì)本檢測(cè)方法不會(huì)造成干擾。

2.7 方法的實(shí)際應(yīng)用

將此熒光探針加入到病毒樣品中進(jìn)行檢測(cè)，效果并不理想。其原因可能如下：(1)病毒樣品中含有大量蛋白質(zhì)和其它分子，它們很容易吸附在GO表面，從而干擾樣品的測(cè)定。(2)檢測(cè)物自身也會(huì)被GO所吸附，特別是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小的蛋白質(zhì)，因吸附在GO表面而影響檢測(cè)效果，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要通過(guò)超聲、振蕩等方式消除目標(biāo)物和GO之間的非特異性吸附。(3)由于熒光探針是利用熒光染料制備而成，熒光染料在一定的pH環(huán)境下帶有電荷，同樣會(huì)與GO表面的活性基團(tuán)產(chǎn)生物理作用，從而影響實(shí)驗(yàn)效果[12]。因此，利用GO作為熒光猝滅劑而建立的熒光分析法需進(jìn)一步改進(jìn)，以提高復(fù)雜樣品中目標(biāo)物的檢測(cè)效果。

3 結(jié)論

建立了一種基于熒光染料和氧化石墨烯的均相免疫法，并用于同時(shí)檢測(cè)三種流感病毒亞型H1N1、H5N1和H9N2，其檢出限分別為0.48 ng/mL、0.46 ng/mL及0.42 ng/mL。方法靈敏度高、選擇性好并且操作簡(jiǎn)便快速，有望在臨床診斷中用于混合樣品中流感病毒篩選和同時(shí)檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用前景。

致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張萬(wàn)坡副教授課題組為本實(shí)驗(yàn)提供流感病毒及抗體。