嚴文靜， 章建浩， 楊龍平， 王永麗

(國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095)

雙酚A(Bisphenol A，BPA)是塑料制備過程中的一種重要原料，廣泛存在于奶瓶、水瓶、牙套、保鮮膜等日常生活用品中。由于BPA在自然環(huán)境中很難降解，所以很容易通過食物鏈富集或食品包裝材料遷移到食品中，進而對人體健康造成嚴重危害[1]。因此，研究和建立BPA快速檢測方法，對于保障人類健康和食品安全具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的BPA檢測多采用氣相色譜和氣-質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜和液-質(zhì)聯(lián)用法等[2]。這些檢測方法前處理過程繁瑣、設備昂貴，不適應食品安全檢測快速、方便、低成本、低污染、高通量檢測的要求[3]。近年來，針對BPA國內(nèi)外許多研究小組開展了這類物質(zhì)的檢測技術(shù)研究，并開發(fā)了一些新型快速檢測方法，如酶聯(lián)免疫法[4]、熒光分析法[5]、電化學分析法[6]等。這些分析方法雖然能彌補上述方法的一些不足，但在實際檢測應用中常常受復雜樣品基質(zhì)干擾，重復性較差[7]。由此，開發(fā)一種快速、穩(wěn)定、高靈敏的BPA檢測方法是目前迫切需要解決的問題。

表面增強拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS)是利用納米材料表面等離子共振對吸附于金屬表面分子的拉曼信號進行增強的現(xiàn)象，增強因子最高可達108～1014倍，具有單分子檢測的潛能[8,9]。SERS的優(yōu)勢還表現(xiàn)在不需要對樣品進行任何的前處理或提取分離，便可以通過分子特有的指紋圖譜，對復雜混合體系中的特定微量成分進行直接檢測[10]，特別適用于復雜食品基質(zhì)中的有毒有害物檢測[11]?；诖诵再|(zhì)，SERS技術(shù)目前已經(jīng)被廣泛用于環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物大分子檢測、疾病診斷、基因分析等領(lǐng)域[12,13]。

本文基于兩種不同尺寸的金、銀納米顆粒，結(jié)合DNA自組裝技術(shù)，制備了高產(chǎn)率、高SERS活性的金-銀納米異質(zhì)二聚體，利用BPA與核酸適配體的特異性識別作用，建立了一種基于金-銀納米異質(zhì)二聚體的SERS傳感檢測體系，實現(xiàn)了BPA的快速、穩(wěn)定、高靈敏定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100HR透射電子顯微鏡(日本，電子株式會社)；UV-1800紫外分光光度計(日本，島津公司)；HR-800顯微激光共聚焦拉曼光譜儀(法國，HORIBA Jobin Yvon公司)；Nano ZS納米粒徑分析儀(英國，馬爾文公司)；Allegra 64R型高速冷凍離心機(美國，Beckman公司)。

HAuCl4(99%)、檸檬酸三鈉、AgNO3、抗壞血酸、NaBH4、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、4-氨基苯硫酚(4-ATP)、雙酚A、雙酚C、雙酚酸、己烯雌酚，均購于Sigma試劑公司。其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為超純水。

實驗中所有單鏈核酸序列均來自上海生工生物技術(shù)有限公司。BPA核酸適配體序列(DNA1)：5′-SH-(T)6-CCGGT GGGTG GTCAGGTGGG ATAGC GTTCC GCGTA TGGCC CAGCGCATCA CGGGT TCGCA CCA-3′;其互補序列(DNA2)：5′-SH-(T)6-CCCAC CTGAC CACCC ACCGG -3′。

1.2 實驗方法

1.2.1納米顆粒的制備參見文獻方法[14]制備金、銀納米顆粒。(1)金納米顆粒的制備：100 mL 0.01%的HAuCl4溶液，勻速攪拌、加熱沸騰持續(xù)7～8 min后，快速加入1.6 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌加熱，待溶液從無色變?yōu)榧t色并不再發(fā)生變化，停止加熱并繼續(xù)攪拌30 min。(2)銀納米顆粒的制備：取100 mL潔凈的錐形瓶置于冰浴中，依次加入40 mL超純水，1.2 mL 0.01 mol/L NaBH4溶液和10 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮溶液。攪拌下，逐滴向瓶中加入10 mL 1%的聚乙烯吡咯烷酮溶液和10 mL 0.1%的AgNO3溶液，溶液從無色逐漸變?yōu)辄S色。將反應物置于溫度80 ℃反應3 h，最后溶液變?yōu)榱咙S色。制備的金、銀納米顆粒溶液放入4 ℃冰箱備用。

采用透射電子顯微鏡，紫外吸收光譜儀及動態(tài)光散射儀對制備的金、銀納米顆粒的形貌、粒徑、分散度等進行表征。

1.2.2納米顆粒表面定向修飾DNA人工合成巰基修飾DNA序列用1倍TE緩沖液稀釋到5 μmol/L濃度，存放在-20 ℃冰箱備用。制備的金、銀納米顆粒，各取1 mL 25 nmol/L于2個不同離心管中，分別向2個管中加入20 μL 5 μmol/L人工合成的DNA溶液，混合均勻后，分別向2管中加入25 μL 1 mol/L的Tris-HCl緩沖液和10 μL 5 mol/L的NaCl溶液，室溫反應12 h后，13 000 r/min離心10 min，去除上清液，加20 mmol/L Tris-HCl恢復到原體積。DNA通過末端的巰基與金、銀納米顆粒形成Au-S或Ag-S 鍵偶聯(lián)在納米顆粒表面。利用瓊脂糖凝膠電泳對納米顆粒偶聯(lián)DNA后的特性進行表征，膠的濃度為1.5%，電壓80 kV，電泳時間100 min。

實驗中采用密度梯度離心法將未偶聯(lián)DNA的納米顆粒從體系中分離。參考文獻方法[14]，具體步驟如下：取1.5 mL 15%的Ficoll 400加入到5 mL離心管中，再將1.5 mL 60%的Ficoll 400輕輕加到底層，取500 μL納米顆粒-DNA溶液加入到離心管的最上層，5 000 r/min離心30 min。由于金-DNA比單個金納米顆粒的體積大，離心后溶液分為兩層，上層為金-DNA，下層為金納米顆粒。取上層溶液，加入超純水離心，沉淀物用超純水分散，再離心重復3～4次，最后得到金-DNA復合物。

1.2.3金-銀納米異質(zhì)二聚體的制備取制備的兩種納米顆粒-DNA復合物各1 mL混合于5 mL離心管中，隨后加入20 μL 5 mol/L NaCl溶液，混合均勻，90 ℃水浴5 min后在水蒸汽中緩慢降到室溫，實現(xiàn)金-銀納米異質(zhì)二聚體的制備。采用密度梯度離心分離法對組裝體進行純化分離，方法參考1.2.2節(jié)。利用透射電子顯微鏡和動態(tài)光散射對異質(zhì)二聚體的結(jié)構(gòu)和尺寸進行表征。

1.2.4異質(zhì)二聚體修飾SERS活性測定及優(yōu)化分別取制備好的金納米顆粒、銀納米顆粒及金-銀納米異質(zhì)二聚體200 μL于3個不同的離心管中，向3個管中加入2 μL 100 μmol/L的4-ATP溶液，室溫反應8 h后，13 000 r/min離心10 min，除去上清液，加入20 mmol/L Tris-HCl緩沖液恢復到原體積，分別測量SERS。測定的激發(fā)波長為514 nm，掃描時間為10 s。

拉曼活性分子的濃度對于金-銀異質(zhì)二聚體的SERS信號強度和體系的分散性有很大的影響，本實驗對4-ATP的濃度進行了優(yōu)化。分別取200 μL制備好的異質(zhì)二聚體于4個不同的管中，每管加入不同量的4-ATP，使得體系中4-ATP的最終濃度分別為0.5、1.0、2.0和5.0 μmol/L，反應結(jié)束后，通過比較溶液SERS信號強度，確定4-ATP的最佳濃度。采用514 nm、633 nm和785 nm三種不同波長的激發(fā)光對組裝體SERS信號進行測定，確定合適的激發(fā)波長。

1.2.5SERS傳感檢測體系的建立及優(yōu)化向制備的金-銀納米異質(zhì)二聚體中，加入一定濃度的BPA溶液，室溫分別反應0、10、20、30、40、50和60 min，測定體系不同反應時間的SERS信號強度，從而確定合適的反應時間。

1.2.6BPA的傳感檢測按照上述優(yōu)化的條件，制備得到高產(chǎn)率、高分散性且具有強SERS信號的金-銀納米異質(zhì)二聚體，分別取200 μL于7個不同的離心管中，每個管中加入5 μL不同濃度的BPA溶液，使得BPA的最終濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/L，反應一定時間后，取100 μL反應液加入到微量石英比色皿中，進行SERS測定。測定的激發(fā)波長為514 nm，掃描時間為10 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)檢測BPA的原理

分別制備兩種尺寸不同的金(25 nm)、銀(10 nm)納米顆粒，將含有BPA核酸適配體的序列(DNA1)通過末端巰基修飾在金納米顆粒表面，其互補序列(DNA2)通過末端巰基修飾在銀納米顆粒表面，通過調(diào)整DNA與納米顆粒的摩爾比，制備得高產(chǎn)率金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)。拉曼活性分子4-ATP通過巰基定向修飾在二聚體的表面，利用異質(zhì)二聚體中兩個粒子之間形成的強烈的電磁場增強，對修飾在表面的4-ATP的拉曼信號進行增強，從而使組裝體表現(xiàn)出強烈的SERS信號。當體系中存在BPA時，會與其對應的核酸適配體競爭性結(jié)合，使得金-銀異質(zhì)二聚體解離，組裝體SERS信號減弱。利用目標物濃度變化與SERS信號的規(guī)律性變化關(guān)系，建立標準曲線，從而實現(xiàn)對BPA的快速檢測。原理如圖1所示。

圖1 基于金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)檢測BPA的原理Fig.1 Schematics of detection of BPA based on self-assembled Au-Ag hetero-dimer nanostructures

2.2 納米顆粒的表征

圖2a、2b分別為金、銀納米顆粒的透射電鏡(TEM)圖，圖中顯示金納米顆粒的尺寸為25±3 nm，銀納米顆粒的尺寸為10±2 nm，這與動態(tài)光散射譜的測量結(jié)果顯示基本吻合(圖2d)。另外，從圖2d可以看出，金、銀的峰形對稱，峰寬較窄，并且當粒徑大于50 nm時沒有明顯的峰，說明制備的納米顆粒分散性好，體系中沒有明顯的聚集體產(chǎn)生。Zeta電位結(jié)果顯示(圖2e)，金、銀納米顆粒的電位分別為-21.9 mV和-2.1 mV，這主要與納米顆粒表面修飾的配體有關(guān)。紫外-可見吸收光譜分別在522 nm和400 nm波長處有明顯的吸收峰，對應于金、銀納米顆粒的等離子體共振吸收峰(圖2c)，峰尖且對稱，說明制備的金、銀納米顆粒形貌均一。

圖2 金、銀納米顆粒透射電鏡(TEM)圖(a、b)，紫外-可見吸收光譜圖(c)，粒徑分布圖(d)和Zeta電位圖(e)Fig.2 TEM images of Au and Ag NPs (a,b)，UV-Vis spectra (c),Dynamic light scattering size distributions (d) and Zeta potential (e)

2.3 納米顆粒表面定向修飾DNA表征

圖3 Au-DNA和Ag-DNA復合物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel images of Au-DNA and Ag-DNA complex

將人工合成的單鏈寡核苷酸序列，通過末端修飾的巰基定向偶聯(lián)在金、銀納米顆粒的表面，為了防止納米顆粒因表面DNA雜交產(chǎn)生大片的聚集體，體系中加入的納米顆粒與DNA的摩爾比為1∶5。實驗中采用瓊脂糖凝膠電泳對納米顆粒偶聯(lián)DNA的結(jié)果進行表征[14]。如圖3所示，電泳方向從上到下，從負極到正極。檸檬酸三鈉制備的金納米顆粒帶負電荷，當表面偶聯(lián)DNA之后，由于DNA的空間阻力，使得偶聯(lián)DNA之后的金納米顆粒相比于沒有偶聯(lián)DNA的金納米顆粒，電泳遷移率較小，條帶位置靠后，如圖3(條帶1和條帶2)。以PVP為保護劑制備的銀納米顆粒不帶電荷，當表面偶聯(lián)DNA后，銀-DNA復合物表面的負電荷增加，電泳遷移率增大，條帶位置靠前，如圖3(條帶3和條帶4)。由于金和銀納米顆粒表面電荷的差異，銀納米顆粒的電泳條帶比金納米顆粒的條帶靠后[15]。根據(jù)文獻報道的方法[16]，對納米顆粒表面DNA的數(shù)量進行了估算，金、銀納米顆粒表面的DNA數(shù)量分別為0.9±0.2和1.2±0.5，有效避免了納米多聚體的形成。

2.4 金-銀納米異質(zhì)二聚體的制備

圖4 金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)透射電鏡(TEM)圖Fig.4 TEM images of Au-Ag hetero-dimer structures

金-銀納米異質(zhì)二聚體的組裝依賴于兩條單鏈DNA的互補雜交，水浴90 ℃ 5 min是為了使折疊的單鏈DNA完全展開，有利于雙鏈雜交。在緩慢降溫的過程中，兩條單鏈DNA按照堿基互補配對原則進行雜交，從而制備得到金-銀納米異質(zhì)二聚體。從圖4顯示可以看出：金、銀納米顆粒組裝有序，組裝體分布均一，沒有出現(xiàn)大片的聚集體。

從圖2中可以看出，金-銀異質(zhì)二聚體分別在520 nm 和409 nm有兩個特征峰，分別對應組裝體中金顆粒和銀顆粒的特征峰，由此也表明異質(zhì)二聚體組裝是成功的。實驗中采用動態(tài)光散射對組裝體的尺寸分布進行了測定，從圖5可以看出：當單個納米顆粒定向組裝成二聚體后，體系的尺寸變大，直徑約為43±3 nm，根據(jù)金、銀納米顆粒的尺寸計算得出二聚體中兩個納米顆粒之間的距離為8±4 nm，符合實驗設計。另外，由圖5可知，當粒徑大于150 nm時，光譜中沒有明顯的信號，說明體系中沒有大片的聚集體產(chǎn)生，有效避免了因聚集體產(chǎn)生的強SERS信號對檢測體系的干擾。

2.5 金-銀異質(zhì)二聚體SERS活性測定及優(yōu)化

實驗中采用4-ATP分別對金納米顆粒、銀納米顆粒及金-銀納米異質(zhì)二聚體進行修飾，4-ATP的濃度均為1 μmol/L。從圖6可以看出，同樣濃度下金-銀異質(zhì)二聚體的SERS信號最強，約為金和銀納米顆粒SERS信號的6倍。其原因在于，當兩個分散的納米顆粒距離十分接近的時候，在兩個納米顆粒之間會形成強烈的電磁場增強區(qū)域，即“熱點”區(qū)域，使得存在于該區(qū)域的拉曼活性分子的拉曼信號會被極大地增強[17]。圖中分別在388、1 078和1 617 cm-1有三個明顯的峰，對應于4-ATP的拉曼特征峰。

圖5 金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)水合粒徑圖Fig.5 Hydrodynamic diameters of Au-Ag hetero-dimer structures

圖6 金-銀異質(zhì)二聚體的SERS圖Fig.6 SERS spectra of Au-Ag hetero-dimer structures

為了研究不同濃度4-ATP對于體系SERS信號強度的影響，實驗中對拉曼活性分子的濃度進行了優(yōu)化。如圖7a所示，隨著4-ATP濃度的增加，體系SERS信號逐漸增加，4-ATP濃度為2 μmol/L時，SERS信號最強；當濃度高于2 μmol/L時，體系的SERS信號減弱。其原因可能是，過多的4-ATP引起納米組裝體聚集，從而使得SERS信號減弱[18]，由此確定4-ATP的最佳濃度為2 μmol/L。另外，本實驗研究了514、633和785 nm三種激發(fā)波長對組裝體SERS信號強度的影響，從圖7b可以看出，采用514 nm時得到的SERS強度最高，其原因可能是514 nm比較接近金和銀的吸收峰，激發(fā)光能夠引起金、銀納米顆粒表面等離子體共振，從而使得SERS信號大大增強[19]。

圖7 異質(zhì)二聚體修飾不同濃度4-ATP的SERS圖譜(a);異質(zhì)二聚體不同激發(fā)光源的SERS圖譜(b)Fig.7 SERS spectra of Au-Ag hetero-dimers with different concentrations of 4-ATP(a);SERS spectra with different excitation source(b)

圖8 異質(zhì)二聚體與BPA反應時間對SERS信號強度的影響Fig.8 Effect of reaction time of hetero-dimers and BPA on the SERS signal intensity

2.6 SERS傳感檢測體系的建立及優(yōu)化

向制備好的高SERS活性的金-銀納米異質(zhì)二聚體中加入一定量的BPA，研究金-銀納米異質(zhì)二聚體與BPA反應時間對體系SERS信號強度的影響，以確定檢測體系的最佳反應時間。實驗以1 078 cm-1處的特征峰強度為對象，建立時間-SERS信號強度的關(guān)系曲線。如圖8所示，當體系中不存在BPA時，隨著時間的延長體系的SERS信號基本不變；當體系中加入5 μg/L的BPA后，隨著時間的延長體系的SERS信號快速下降，反應30 min后基本保持不變。由此確定BPA與檢測體系的最佳反應時間為30 min。

2.7 BPA的傳感檢測

基于上述制備好的金-銀納米異質(zhì)二聚體，進行了不同濃度BPA的快速檢測。檢測體系中BPA的終濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 μg/L。反應30 min后，測量SERS信號強度。如圖9所示，隨BPA濃度增加體系的SERS信號逐漸減弱，以1 078 cm-1處特征峰為目標建立標準曲線。從圖10可見，BPA濃度在0.05～10 μg/L呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=-157.9lnx+730.4(R2=0.9904)，檢測限為0.038 μg/L。

圖9 不同濃度BPA的SERS光譜圖Fig.9 SERS spectra under different concentrations of BPA

圖10 BPA檢測標準曲線圖Fig.10 Standard curve of the determination of target BPA

圖11 檢測體系特異性分析圖Fig.11 Selectivity of the hetero-dimers detecting system towards BPA,BPC,DPA and DEC

2.8 檢測方法特異性分析

為了驗證該檢測方法的特異性，配制濃度為5 μg/L的雙酚A(BPA)、雙酚C(BPC)、雙酚酸(DPA)、己烯雌酚(DEC)溶液，按照本實驗構(gòu)建的檢測方法，按步驟加入到檢測體系中，通過測定1 078 cm-1處拉曼特征峰的強度進行比較。結(jié)果如圖11所示，除了BPA外，其他物質(zhì)均不會引起體系SERS信號變化，證明本檢測方法具有良好的特異性。

2.9 實際樣品的加入回收實驗

考察了該檢測方法對實際牛奶樣品中BPA的響應，結(jié)果如表1所示，當樣品加入BPA的最終濃度為0.1、0.5、1.0、5.0 μg/L時，得到的回收率在89.8%～108.0%之間，說明本方法BPA檢測方法準確性高，可以應用于實際樣品中BPA的檢測。

表1 牛奶樣品中添加BPA的檢測回收率

3 結(jié)論

本實驗基于金、銀納米顆粒及DNA模板自組裝技術(shù)，構(gòu)建了一種具有高SERS活性的金-銀納米異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)，并成功用于BPA的快速、高靈敏的定量分析。在最優(yōu)條件下，BPA濃度在0.05～10 μg/L之間具有良好的線性(R2=0.9904)，檢測限為0.038 μg/L。與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有快速、高靈敏、高特異性、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點，并且能在30 min內(nèi)實現(xiàn)檢測。利用該方法可以對實際樣品進行定量檢測，具有較好的應用價值。