劉少靜， 劉 萌， 郭秀英， 韓 祿， 楊黎彬*

(西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安 710021)

枸杞是茄科植物枸杞的干燥成熟果實，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有調節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、調節(jié)血脂、降血糖、促進造血功能等藥理方面的作用[1,2]。近年來，中藥化妝品已成為化妝品新產品開發(fā)的熱點之一。有報道顯示，枸杞提取液可顯著提高小鼠皮膚中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加皮膚中膠原蛋白含量，減少脂質過氧化產物丙二醛的含量，具有延緩皮膚衰老的作用[3]。另有文獻報道枸杞中酚酸類化合物具有很好的生物活性，如阿魏酸有抗血栓、清除自由基、抗菌消炎等作用；咖啡酸和綠原酸可抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗氧化清除自由基等[4,5]。

目前，對枸杞中酚酸類物質及其它成分的檢測已有較多報道[6 - 8]，但枸杞在化妝品領域的應用及化妝品中酚酸類物質的檢測技術報道則不多見。本研究建立了同時測定自制枸杞潤膚霜中綠原酸和咖啡酸2種酚酸類物質的高效液相色譜(HPLC)分析及質譜(MS)確證方法，該方法能夠為化妝品中酚酸的監(jiān)測提供科學依據，同時為枸杞在化妝品領域的應用開辟廣闊的前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 1260型高效液相色譜儀(美國，安捷倫科技有限公司)；Agilent 1260/6460液相色譜-質譜聯用儀(美國,安捷倫科技有限公司)；FA1004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-160A紫外檢測儀(日本，島津公司)；L-550臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

綠原酸、咖啡酸對照品(純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所提供)；枸杞(黑果枸杞，產地：青海，由西安醫(yī)學院藥學院馮永輝副教授鑒定)；枸杞潤膚霜(實驗室自制)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Aglient HC-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

圖1 標準品和樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards and the sampleA.standard;B.the sample of wolfberry cream;C.blank matrix.1.chlorgenic acid;2.caffeic acid.

1.3 液相色譜-質譜確證條件

液相色譜條件：色譜柱：UItisiLTMXB-C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%乙酸水溶液(27∶73，V/V)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

質譜條件：ESI電離源；負離子掃描模式；干燥氣(N2)體積流量為12 L/min；干燥氣溫度為250 ℃；霧化器壓力為70.00 psi；質量掃描范圍：m/z80～1 000；碰撞能量：17 eV。綠原酸母離子、子離子(m/z)分別為353.3、191；咖啡酸母離子、子離子(m/z)分別為179、135。

1.4 標準溶液的配制

分別精密稱取綠原酸，咖啡酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，制得2個對照品濃度分別為500 μg/mL、450 μg/mL的對照品儲備液。用甲醇將2個對照品儲備液按不同倍數稀釋，制得系列混合對照品溶液。其中綠原酸濃度依次為：250、125、50、25、10、5、3.3 μg/mL，咖啡酸濃度依次為：225、112.5、45、22.5、9、4.5、3 μg/mL，4 ℃冷藏備用。

1.5 枸杞潤膚霜樣品前處理

精密稱取自制枸杞潤膚霜1.0019 g置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲震蕩提取20 min，提取液轉移至離心管中，以4 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，濾液待測。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

本實驗采用甲醇-HAc為流動相，實驗考察了不同濃度的酸對目標成分分離效果的影響，分別采用甲醇-0.5%HAc、甲醇-0.1%HAc、甲醇-1%HAc對樣品進行等度洗脫，結果表明在甲醇-0.5%HAc的條件下主峰與其它雜質峰分離度及峰形均良好，可實現準確定量分析枸杞及枸杞潤膚霜中酚酸類有效成分的目的。為避免樣品中雜質的干擾，經反復試驗，最終確定甲醇-0.5%HAc水溶液的最佳比例為27∶73。

2.2 檢測波長的選擇

對一定濃度的綠原酸和咖啡酸標準溶液進行全波長掃描。結果表明：綠原酸、咖啡酸均在280 nm、327 nm波長處有吸收，但在327 nm處有最大吸收，故選擇327 nm為檢測波長。

2.3 柱溫的選擇

柱溫對目標化合物的色譜保留及分離選擇性有一定的影響。本研究考察了柱溫25～40 ℃下的分離情況。結果表明，當柱溫為30 ℃時，目標化合物的色譜峰之間實現了良好的分離。

優(yōu)化色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.4 定量標準曲線的繪制

精密吸取系列混合對照品溶液各10 μL，按照“1.2”節(jié)色譜條件進樣分析，以各酚酸的進樣濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

表1 2種成分的回歸方程、相關系數與線性范圍

2.5 精密度試驗

選取一個濃度下的混合對照品溶液，按照“1.2”節(jié)色譜條件，連續(xù)進樣5次，測得綠原酸、咖啡酸峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.18%、1.36%，表明精密度良好。

2.6 回收率試驗

精密稱取同一批已知含量的自制枸杞潤膚霜5份，各約0.5 g，置于10 mL容量瓶中。分別加入綠原酸、咖啡酸對照品溶液適量，制成供試品溶液，按照“1.2”節(jié)進樣分析。測得綠原酸、咖啡酸加標回收率見表2。由表2可見：綠原酸、咖啡酸平均加標回收率分別為98.28%、99.26%；RSD均為1.93%。

表2 綠原酸及咖啡酸加樣回收率實驗結果(n=5)

2.7 樣品測定

稱取枸杞潤膚霜適量，按照“1.5”節(jié)方法制備樣品溶液，平行處理3份樣品，應用本方法進行測定，計算綠原酸和咖啡酸的含量，結果見表3。自制的枸杞潤膚霜中綠原酸、咖啡酸含量分別為0.0398 mg/g、0.0323 mg/g。

表3 枸杞潤膚霜中兩種酚酸類成分的含量測定結果

3 結論

目前在化妝品領域尚未有枸杞中酚酸類成分含量的測定方法，對用于中藥化妝品的枸杞的檢測存在空白。本研究建立了同時測定自制枸杞潤膚霜中2種酚酸類物質的高效液相色譜分析及質譜確證方法，該方法具有操作簡便、回收率高、精密度良好等特點，為化妝品中酚酸的監(jiān)測工作和質量控制提供科學依據，同時為枸杞在化妝品領域的應用開辟了廣闊的前景。