劉長青， 廖秀芬， 陶慧林*， 孫 超， 徐 杰

(1.青海省有色地質(zhì)礦產(chǎn)勘查局地質(zhì)礦產(chǎn)勘查院測試中心,青海西寧 810006；2.桂林理工大學化學與生物工程學院,廣西桂林 541004)

胰蛋白酶在脊椎動物中起消化作用，還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，是特異性最強的蛋白酶[1,2]，而且是決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列不可缺少的工具。此外，胰蛋白酶的測定對于研究胰腺的外分泌功能起著至關(guān)重要的作用[3]。在正常人的尿液中基本不含胰蛋白酶，但是在患有急性胰腺炎的病人的尿液中，胰蛋白酶的含量卻很高(平均含量 84.4 μg/mL)[4]。因此，建立測定尿液中胰蛋酶的方法在臨床診斷中具有重要意義。

目前，測定胰蛋白酶的方法主要有比色法[5,6]、色譜法[7]、電化學法[8]、熒光分析法[9,10]、化學發(fā)光法[11]、酶聯(lián)免疫法[12]等。本文提出了利用異硫氰酸熒光素(FITC)-牛血清白蛋白(BSA)-Pb2+熒光探針測定胰蛋白酶的方法。實驗表明，在表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(DBS)存在下，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+發(fā)出較強的熒光，此時探針處于“打開”狀態(tài)。而當加入胰蛋白酶后，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+的熒光強度發(fā)生了相應(yīng)的猝滅，探針被“關(guān)閉”。利用胰蛋白酶的濃度與FITC-BSA-Pb2+探針的熒光猝滅程度的線性關(guān)系，建立了一種測定尿液中胰蛋白酶的新方法。該方法靈敏度高，檢出限低，線性范圍寬，操作簡單，對環(huán)境要求低。已經(jīng)成功應(yīng)用于實際樣品的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

RF-5301PC型熒光光度計(日本，島津公司)；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；pHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；FA1104電子分析天平(中國江蘇泰興市電子儀器廠)。

Pb2+儲備溶液：200 μg/mL，使用時稀釋至相應(yīng)的濃度。異硫氰酸熒光素(FITC)，胰蛋白酶，牛血清蛋白(BSA)(國藥集團化學試劑有限公司)，十二烷基苯磺酸鈉(DBS)，Tris-HCl緩沖溶液。實驗所用試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 FITC-BSA的合成

稱取0.040 g FITC溶于10 mL的二甲亞砜(DMSO)中，另取0.067 g的BSA溶于10 mL pH=9.0的Na2CO3溶液中。然后分別吸取2.5 mL配制好的FITC溶液和BSA溶液于25 mL的比色管中，用pH=9.0的Na2CO3稀釋至25 mL。將上述配好的溶液于溫度4 ℃下避光反應(yīng)24 h，裝入處理好的透析袋中，用Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液透析24 h，再用水透析直至溶液呈無色為止。

1.3 檢測方法

于一系列5 mL的比色管中，依次加入2.5 mL 1.0×10-6mol/L已合成的FITC-BSA，60 μL 2 μg/mL 的Pb2+溶液，20 μL 0.10 g/L的DBS溶液和一定量的胰蛋白酶，用pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，搖勻。于溫度40 ℃下反應(yīng)5 min后，測定其相應(yīng)的熒光強度。儀器的激發(fā)和發(fā)射熒光狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 FITC-BSA的光譜特性

對所合成的BSA-FITC進行紫外-可見光譜和熒光光譜表征。由圖1(A)可知，BSA的紫外吸收峰在278 nm(a)，F(xiàn)ITC的吸收峰在489 nm(b)，而合成的BSA-FITC體系吸收峰在451 nm(c)。BSA-FITC探針的吸收峰位置與FITC、BSA都不一樣，且吸收峰的峰形與峰高與FITC、BSA相比也發(fā)生了明顯的變化。圖1(B)為FITC、BSA溶液和FITC-BSA溶液的熒光光譜，由圖1(B)可知，BSA的熒光光譜在350 nm處(a)，F(xiàn)ITC的熒光光譜在460 nm處(b)，而FITC-BSA的熒光光譜在463 nm處(c)，且與FITC相比，F(xiàn)ITC-BSA熒光光譜的半峰寬基本不變。以上結(jié)果證明，本實驗成功合成了FITC-BSA熒光探針。

圖1 (A)BSA(a)、FITC(b)和FITC-BSA(c)的紫外-可見吸收光譜；(B) BSA(a)、FTIC(b)和FITC-BSA(c)的熒光光譜Fig.1 (A) UV-Vis absorption spectra of BSA(a),FITC(b) and FITC-BSA(c)；(B) Fluorescence spectra of BSA(a),FITC(b) and BSA-FITC(c)

2.2 Pb2+及DBS對BSA-FITC體系熒光的增強作用

圖2 Pb2+對FITC-BSA體系熒光強度的影響Fig.2 Effects of Pb2+ on the fluorescence intensity of FITC-BSA systema：FITC-BSA；b:FITC-BSA-Pb2+.

實驗發(fā)現(xiàn)Pb2+溶液能有效增強FITC-BSA探針的熒光(圖2)，使探針變得更靈敏。進一步考察了Pb2+溶液濃度對FITC-BSA體系的影響，結(jié)果表明加入60 μL的2 μg/mL的Pb2+時，探針的熒光強度達到最大。此外，表面活性劑可降低分子表面張力，形成膠束，縮短分子間距離，利于探針熒光的激發(fā)。因此考察了不同表面活性劑對體系的影響，實驗表明加入20 μL 0.1 g/L的DBS時，體系的熒光強度大大增強。

因此，在后面實驗中選擇加入60 μL 2 μg/mL的Pb2+和20 μL 0.10 g/L的DBS，以增強探針的熒光，此時探針處于被“打開”狀態(tài)。

2.3 胰蛋白酶對FITC-BSA-Pb2+探針的熒光“關(guān)閉”作用

分別考察了胰蛋白酶對FITC、FITC-BSA和FITC-BSA-Pb2+體系熒光強度的影響，結(jié)果如圖3(A)所示。胰蛋白酶對FITC基本沒有猝滅作用，對FITC-BSA體系有較大的熒光猝滅效果，然而在FITC-BSA-Pb2+體系中，胰蛋白酶可以靈敏地猝滅體系的熒光。用BSA修飾的FITC能被胰蛋白酶有效猝滅，可能是因為胰蛋白酶使合成物中BSA分解，F(xiàn)ITC-BSA結(jié)構(gòu)受到破壞，從而使體系的熒光發(fā)生猝滅。通過紫外-可見吸收光譜探討了胰蛋白酶對FITC-BSA-Pb2+探針的熒光猝滅機理。由圖3(B)可知，加入胰蛋白酶后，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+探針的紫外吸收減弱，說明原來探針結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)受到破壞，驗證了上述結(jié)論。根據(jù)文獻報道[13]，在某些金屬離子存在下，胰蛋白酶可以有效被活化。因此，在Pb2+存在下，體系的熒光能被胰蛋白酶有效猝滅可能是因為Pb2+能有效活化胰蛋白酶。

圖3 (A) 胰蛋白酶對FITC、FITC-BSA和FITC-BSA-Pb2+熒光強度的影響；(B) 加入胰蛋白酶前(a)后(b)FITC-BSA-Pb2+紫外-可見吸收光譜Fig.3 (A) Effects of trypsin on the fluorescence intensity of FITC，F(xiàn)ITC-BSA and FITC-BSA-Pb2+;(B) UV-Vis absorption spectra of FITC-BSA-Pb2+ before(a) and after(b) the addition of trypsin cFITC =5.0×10-7 mol /L,cPb2+ =0.24 μg/mL,ctrypsin=12 μg/mL.

2.4 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的熒光猝滅條件，實驗考察了pH、緩沖介質(zhì)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等對體系的影響。因為胰蛋白酶存在人或動物體內(nèi)，所處的pH環(huán)境在7～8之間，溫度環(huán)境在30～40 ℃之間。因此考察了pH在7～8之間的緩沖液和30～40 ℃之間反應(yīng)溫度對FITC-BSA-Pb2+-胰蛋白酶體系的影響。實驗結(jié)果表明，在pH=7.8的Tris-HCl緩沖液中胰蛋白酶對FITC-BSA-Pb2+探針的熒光猝滅值最大，體系在反應(yīng)5 min內(nèi)完成并且可以穩(wěn)定1 h以上。

2.5 工作曲線

隨著胰蛋白酶的加入，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+探針的熒光被猝滅(圖4(A))，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+探針處于“關(guān)閉”的狀態(tài)。在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+體系的熒光猝滅程度與胰蛋白酶的量呈良好的線性關(guān)系。在最佳實驗條件下繪制工作曲線，結(jié)果如圖4(B)所示。胰蛋白酶的濃度在2.4～24 μg/mL范圍內(nèi)，體系的熒光猝滅值△IF與胰蛋白酶的濃度(c,mol /L)呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為：△IF=13.3c+17.9，相關(guān)系數(shù)r=0.9972，用3σ/k方法計算得檢出限為0.80 μg/mL。

圖4 (A) 胰蛋白酶對FITC-BSA-Pb2+熒光的猝滅曲線;(B) 標準曲線 Fig.4 (A) Fluorescence quenched curves of FITC-BSA-Pb2+ system by trypsin;(B) The standard curve cFITC-BSA=5.0×10-7 mol/L;cPb2+=0.24 μg/mL.a-j:cTrypsin:0.0,2.4,4.8,7.2,9.6,12.0,14.4,16.8,19.2,21.6,24.0 μg/mL.

2.6 干擾實驗

2.7 樣品分析

采取新鮮尿液約20 mL于小燒杯中，靜置0.5 h后，取上清液5.00 mL裝入已處理好的透析袋，于水中透析24 h。按1.3的實驗方法測定胰蛋白酶的含量，并進行加標回收實驗。結(jié)果如表1所示。由表1可知，方法的回收率在102.1%～106.0%之間，相對標準偏差(RSD)≤ 3.0%(n=6)。以上結(jié)果表明所建立的新方法具有較高的準確度與精密度，可用于實際樣品的分析。

表1 尿樣分析結(jié)果

3 總結(jié)

本文合成了FITC-BSA熒光探針，并用Pb2+對探針進行增敏，實驗發(fā)現(xiàn)FITC-BSA-Pb2+在DBS的存在下，可以發(fā)出較強的熒光。建立了利用FITC-BSA-Pb2+熒光探針測定胰蛋白酶的新方法。在溫度30～40 ℃環(huán)境下，于pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液中加入胰蛋白酶后，F(xiàn)ITC-BSA-Pb2+體系的熒光發(fā)生猝滅，且胰蛋白酶濃度與體系熒光猝滅的強度在2.4～24 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9972，檢出限為0.80 μg/mL。該方法應(yīng)用于尿液中胰蛋白酶的測定，結(jié)果表明所建立方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單等特點，同時具有較高的準確度和精密度。在疾病的臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。