楊文慧， 冀 旭， 邊六交*

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069)

作為從分子水平上闡明生命奧秘的中心課題之一，蛋白質(zhì)分子的去折疊和重折疊過(guò)程一直受到生物化學(xué)、生物物理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等領(lǐng)域研究者的高度關(guān)注。目前普遍認(rèn)為完全的去折疊或重折疊過(guò)程往往不是一步就能達(dá)到的[1 - 5]，而是存在一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)[6,7]，它們對(duì)研究蛋白質(zhì)分子的功能、自構(gòu)、折疊和集聚等都具有重要意義[8 - 10]。

研究蛋白分子去折疊和重折疊過(guò)程時(shí)，常用細(xì)胞色素C、卵清溶菌酶[11,12]等分子量較小、結(jié)構(gòu)比較緊湊的蛋白質(zhì)以及牛碳酸酐酶B[13,14]作為模型蛋白分子。本實(shí)驗(yàn)室曾分別研究和比較了由變性劑誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的豬胃蛋白酶[15]和牛血清白蛋白[16]分子的去折疊過(guò)程，并對(duì)這兩種蛋白折疊中間態(tài)的分布和過(guò)渡進(jìn)行了研究[17]；也對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的分子量較大但結(jié)構(gòu)又不過(guò)于復(fù)雜的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去折疊過(guò)程進(jìn)行了研究[18]。在該研究基礎(chǔ)上，本文利用變性和非變性電泳、體積排阻色譜、內(nèi)源熒光發(fā)射光譜、熒光相圖、熒光猝滅以及活性測(cè)定等組合分析方法研究了變性劑脲誘導(dǎo)的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去/重折疊過(guò)程，并與一般常用的分子量較小的蛋白分子的去/重折疊過(guò)程進(jìn)行比較,為以后研究分子量更大、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子的去/重折疊過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4500型熒光光譜儀、U-3310型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，日立公司)；LC-10A型高壓液相色譜儀(日本，島津公司)；Mini-Protein?Ⅱ垂直板蛋白電泳儀(美國(guó),Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(法國(guó),Viber Lovrmat公司)。

淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶(Bacillusamyloliquefaciensα-amylase)、脲和鹽酸胍(純度均>99%)，均為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1去折疊及重折疊稱取適量α-淀粉酶，分別溶于含不同濃度脲的pH=7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，使α-淀粉酶的終濃度為6.0 mg/L。室溫下放置過(guò)夜使其不同程度去折疊；稱取適量α-淀粉酶，溶于10.0 mol/L脲溶液中，放置過(guò)夜使其完全去折疊。將上述變性酶溶液稀釋成含不同脲濃度的6.0 mg/L的α-淀粉酶溶液，放置過(guò)夜使其不同程度重折疊。同時(shí)，稱取適量α-淀粉酶，溶于8.0 mol/L鹽酸胍溶液中使其完全去折疊，將該變性α-淀粉酶溶液稀釋成含不同鹽酸胍濃度的6.0 mg/L的α-淀粉酶樣品溶液，放置過(guò)夜使其不同程度重折疊。

1.2.2電泳通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)，對(duì)上述脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶的去折疊和重折疊過(guò)程以及鹽酸胍誘導(dǎo)的酶分子重折疊過(guò)程進(jìn)行電泳分析。分離膠濃度8%，濃縮膠濃度5%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.3體積排阻色譜采用高效體積排阻色譜法，對(duì)上述脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程，以及鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程進(jìn)行了體積排阻色譜分析。色譜柱為Shimadzu Shim-pack DIOL-300柱(25 cm×7.9 mm)，流動(dòng)相為含0.2 mol/L Na2SO4的10.0 mmol/L PBS(pH=7.0)，流速1.0 mL/min，280 nm檢測(cè)，上樣50 μL。

1.2.4去折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖扣除對(duì)照體系熒光后，測(cè)定上述不同變性程度α-淀粉酶的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜,及在320 nm和365 nm波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度I320和I365，繪制熒光相圖。對(duì)照體系除不含α-淀粉酶外，其余成分和濃度均與上述變性樣品溶液相同。儀器參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，掃描范圍300～400 nm，掃描速度1 200 nm/min。

1.2.5重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖方法及儀器參數(shù)設(shè)置同1.2.4。

同時(shí)用此方法研究了鹽酸胍誘導(dǎo)的變性α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖。

1.2.6去折疊和重折疊過(guò)程的熒光猝滅選擇丙烯酰胺和KI作為α-淀粉酶分子的熒光猝滅劑。按照Lehrer[19]和Eftink[20]的方法，以丙烯酰胺為猝滅劑，將其加入到不同程度變性和復(fù)性的α-淀粉酶樣品溶液中。樣品中α-淀粉酶的濃度為1.0×10-6mol/L，丙烯酰胺的濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.4、0.5、1.0 mol/L，室溫放置2 h后進(jìn)行光譜測(cè)定?？鄢龑?duì)照體系熒光后，取最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer公式作圖；而以KI作為猝滅劑時(shí)，用0.1 mol/L PBS(pH=7.0)配制5.0 mol/L的KI溶液(其中含2.0 mmol/L Na2S2O3，以防止I3-的生成)，將其加入不同程度變性和復(fù)性的α-淀粉酶樣品溶液中，樣品中α-淀粉酶的濃度均為 1.0×10-6mol/L，KI的濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L，放置2 h后進(jìn)行光譜測(cè)定。扣除對(duì)照體系熒光后，取最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，根據(jù)Stern-Volmer公式作圖。儀器參數(shù)設(shè)置同1.2.4。

1.2.7去折疊和重折疊過(guò)程的生物活性測(cè)定稱取適量α-淀粉酶，分別溶于含不同濃度脲的0.1 mol/L的PBS(pH=7.0)中，酶的終濃度為0.75 mg/L。室溫下放置過(guò)夜使其不同程度去折疊。以1.0%(m/V)淀粉溶液為底物在540 nm下測(cè)定樣品溶液吸光值來(lái)確定α-淀粉酶的生物活性。以天然酶活性為100%，以不同脲濃度下α-淀粉酶的殘余活性率對(duì)脲濃度作圖。脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的生物活性測(cè)定方法基本同上，只是要先將適量α-淀粉酶溶于含10.0 mol/L脲的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中放置過(guò)夜使其完全去折疊，然后將它們稀釋到不同脲濃度下稀釋復(fù)性后進(jìn)行活性測(cè)定。鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶去折疊和重折疊過(guò)程的生物活性測(cè)定方法同上，以7.0 mol/L鹽酸胍變性過(guò)夜。

2 結(jié)果與討論

2.1 去折疊和重折疊過(guò)程的電泳分析

圖1和圖2為變性α-淀粉酶復(fù)性液的SDS-PAGE和Native-PAGE圖譜。SDS-PAGE結(jié)果表明α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液僅在分子量約50 kD處有一條帶，這表明在α-淀粉酶的復(fù)性過(guò)程中，酶分子始終以單分子形式存在于溶液中，并沒(méi)有任何形式的聚集體形成。我們同時(shí)對(duì)α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液進(jìn)行了Native-PAGE分析，結(jié)果表明α-淀粉酶的稀釋復(fù)性液中也僅僅存在一條單分子條帶。α-淀粉酶的變性液電泳分析中，也得到了類似的結(jié)果。這表明在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的變性過(guò)程和變性α-淀粉酶分子的稀釋復(fù)性過(guò)程中，酶分子只以單分子狀態(tài)存在，并沒(méi)有通過(guò)非共價(jià)鍵作用產(chǎn)生任何形式的聚集或沉淀。同時(shí)，對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的電泳分析也表明，在鹽酸胍誘導(dǎo)的稀釋復(fù)性過(guò)程中，酶分子同樣是以單分子形式存在于緩沖溶液中，沒(méi)有任何形式的聚集體形成。

圖1 含不同濃度脲的α -淀粉酶復(fù)性液的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE images of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea Lanes 1-2 and 4-8:urea concentrations are 1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 and 8.0 mol/L,respectively;lane 3:protein molecular weight marker(from top to bottom,the molecular weights are 200.0,116.0,97.2,66.4 and 44.3 kD,respectively).

圖2 含不同濃度脲的α -淀粉酶復(fù)性液的Native-PAGE圖Fig.2 Native-PAGE images of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea Lanes 1-7:urea concentrations are 0.0,8.0,6.0,4.0,3.0,2.0 and 1.0 mol/L,respectively.

2.2 去折疊和重折疊過(guò)程的凝膠排阻色譜分析

圖3僅給出了脲變性的α-淀粉酶分子分別在含8.0、4.0、1.0 mol/L脲的復(fù)性液中稀釋復(fù)性的凝膠排阻色譜分析?？梢钥闯觯煌瑥?fù)性程度的α-淀粉酶分子都僅有一個(gè)主色譜峰，出現(xiàn)在約8.4 min，與天然態(tài)酶分子的出峰時(shí)間一致，且經(jīng)Bradford法分析表明該峰為蛋白峰。在不同脲濃度的α-淀粉酶分子變性液中，樣品的凝膠排阻色譜分析也出現(xiàn)類似結(jié)果。這表明在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程中，沒(méi)有任何形式的α-淀粉酶分子間的聚集體出現(xiàn)。在鹽酸胍誘導(dǎo)的變性α-淀粉酶分子的復(fù)性過(guò)程中，凝膠排阻色譜分析圖譜也呈現(xiàn)類似結(jié)果。

圖3 變性α -淀粉酶在含不同濃度脲的復(fù)性液中的體積排阻色譜分析Fig.3 Size-exclusion chromatograms of denatured Bacillus α -amylase in the renaturation solutions containing different concentrations of urea a,b and c:urea concentrations are 8.0,4.0 and 1.0 mol/L,respectively;d:native Bacillus α -amylase.

2.3 去折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖

圖4給出了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶去折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光發(fā)射圖譜?？梢钥闯?，在脲濃度從0.0 mol/L逐漸增加到4.0 mol/L的過(guò)程中，隨著脲濃度的增加，α-淀粉酶的最大熒光發(fā)射峰位置無(wú)明顯變化，但其熒光發(fā)射強(qiáng)度迅速降低(4.0 mol/L脲時(shí)的熒光發(fā)射強(qiáng)度僅是天然態(tài)α-淀粉酶分子熒光發(fā)射強(qiáng)度的60%)；而在脲濃度從4.0 mol/L繼續(xù)增加到8.0 mol/L的過(guò)程中，隨著脲濃度的增加，α-淀粉酶分子的最大熒光發(fā)射峰發(fā)生明顯紅移，由334 nm移至約355 nm處，且其熒光發(fā)射強(qiáng)度快速升高(8.0 mol/L脲時(shí)的熒光發(fā)射強(qiáng)度上升到天然態(tài)酶的80%)。圖4結(jié)果表明隨著溶液中脲濃度的逐漸增大，α-淀粉酶分子中色氨酸殘基逐漸由其分子內(nèi)部過(guò)渡到分子表面，并最終可能完全暴露于溶液中。由此推測(cè)，在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性過(guò)程中，隨著溶液中脲濃度的逐漸增加，天然態(tài)α-淀粉酶分子逐步失去其三維立體結(jié)構(gòu)；當(dāng)脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)，溶液中存在一個(gè)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的α-淀粉酶分子的部分折疊中間態(tài)。

為了進(jìn)一步證實(shí)上述推斷，我們同時(shí)研究了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊過(guò)程的熒光相圖。由圖5可以看出，脲誘導(dǎo)的該酶分子去折疊過(guò)程的熒光相圖由兩條斜率不同的直線組成，它們相交處的脲濃度約為4.0 mol/L。進(jìn)一步表明脲誘導(dǎo)的該酶分子的去折疊過(guò)程是一個(gè)序變過(guò)程，在脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)存在一個(gè)部分折疊中間態(tài)，其去折疊過(guò)程符合“三態(tài)模型”。

圖4 脲誘導(dǎo)的α -淀粉酶去折疊過(guò)程的熒光發(fā)射光譜圖Fig.4 Fluorescence emission spectra of Bacillus α -amylases during the urea-induced unfolding procedure Urea concentration values in mol/L were indicated for the corresponding emission spectral curves.

圖5 脲誘導(dǎo)的α -淀粉酶去折疊過(guò)程的熒光相圖Fig.5.Fluorescence phase diagram of Bacillus α -amylase during the urea-induced unfolding procedure Urea concentrations values in mol/L were indicated in the vicinity of the corresponding curves.

2.4 重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖

圖6給出了脲變性α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光發(fā)射圖譜?？梢钥闯觯?dāng)溶液中脲濃度為8.0 mol/L時(shí)，完全變性的該酶分子的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)接近于自由色氨酸在水溶液中的最大發(fā)射波長(zhǎng)。隨著脲濃度的降低，該酶的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)顯著變化，但熒光強(qiáng)度迅速下降。當(dāng)溶液中脲濃度降至4.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶的熒光強(qiáng)度降至最低；當(dāng)溶液中脲濃度從4.0 mol/L進(jìn)一步降低至0.1 mol/L時(shí)，該酶的最大熒光發(fā)射峰藍(lán)移至334 nm左右，接近于天然態(tài)α-淀粉酶分子的最大熒光發(fā)射峰位，且熒光強(qiáng)度也迅速回升。該結(jié)果表明，隨著溶液中脲濃度的逐漸降低，α-淀粉酶分子由原來(lái)松散、色氨酸殘基完全暴露于溶液中的結(jié)構(gòu)逐步進(jìn)行折疊，色氨酸殘基逐漸向分子內(nèi)部過(guò)渡，并大部分埋入分子內(nèi)的非極性區(qū)域。當(dāng)溶液中脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)，可能存在一個(gè)過(guò)渡態(tài)的、結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)。

圖7給出了脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的熒光相圖。由圖可以看出，脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的熒光相圖中兩條斜率不同的直線相交處脲濃度約為4.0 mol/L。這也進(jìn)一步證實(shí)脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程是一個(gè)序變過(guò)程，當(dāng)溶液中脲濃度約為4.0 mol/L時(shí)存在一個(gè)α-淀粉酶分子的部分折疊中間態(tài)，其重折疊過(guò)程符合“三態(tài)模型”。

圖6 脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶重折疊過(guò)程的熒光發(fā)射光譜圖Fig.6 Fluorescence emission spectra of denatured Bacillus α -amylase during the urea-induced refolding procedure Urea concentration values in mol/L were indicated for the corresponding emission spectra curves.

圖7 脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶重折疊過(guò)程的熒光相圖Fig.7 Fluorescence phase diagram of denatured Bacillus α -amylase during the urea-induced refolding procedure Urea concentrations in mol/L were indicated in the vicinity of the corresponding curves.

通過(guò)比較脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊和重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光光譜和熒光相圖，我們推測(cè)：脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程可能是相互可逆的。此外，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的熒光發(fā)射光譜和熒光相圖顯示：當(dāng)溶液中鹽酸胍濃度從7.0逐漸降低至1.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子從完全去折疊態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變成一個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)；當(dāng)鹽酸胍濃度進(jìn)一步從1.0 mol/L逐漸減少到0.1 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子會(huì)進(jìn)一步從這個(gè)部分折疊中間態(tài)逐漸折疊轉(zhuǎn)變成近天然構(gòu)象。這表明，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的重折疊過(guò)程也符合“三態(tài)模型”，與它們的去折疊過(guò)程相同[18]。因此我們進(jìn)一步推測(cè)，鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程也可能是相互可逆的。

蛋白質(zhì)分子在變性劑誘導(dǎo)變性后，其天然態(tài)分子所具有的致密空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，原來(lái)包埋于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，多肽鏈處于一種松散狀態(tài)。隨著溶液中變性劑濃度的降低，這些松散的多肽鏈在熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)下會(huì)折疊形成一種熔球態(tài)，而熔球態(tài)大量的疏水殘基暴露在溶劑中會(huì)使不同多肽鏈間的疏水作用力增強(qiáng)，這就有可能驅(qū)使中間體之間形成聚集。這里所選擇的α-淀粉酶分子中不含二硫鍵和游離的半胱氨酸殘基，這就保證了它們之間不會(huì)由于二硫鍵錯(cuò)配而形成分子聚集體。無(wú)論是鹽酸胍或脲作為變性劑，在α-淀粉酶的去折疊和重折疊過(guò)程中都存在一個(gè)穩(wěn)定的部分折疊中間態(tài)，即熔球態(tài)。但通過(guò)SDS-PAGE，Native-PAGE和高效凝膠排阻層析檢測(cè)結(jié)果表明，α-淀粉酶分子并未形成聚集體。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)脲誘導(dǎo)的豬胰腺α-淀粉酶分子稀釋復(fù)性過(guò)程的研究結(jié)果[15]，我們發(fā)現(xiàn)這兩種不同來(lái)源的α-淀粉酶分子所形成的中間態(tài)均不會(huì)通過(guò)疏水作用而產(chǎn)生分子間聚集。

2.5 去折疊過(guò)程的熒光猝滅

在蛋白分子的熒光猝滅研究中，對(duì)于單個(gè)熒光基團(tuán)的均一溶液體系，其猝滅過(guò)程可用Stern-Volmer公式(1)和(2)進(jìn)行分析[21,22]：

(1)

(2)

其中,F0和F分別表示加入猝滅劑前后蛋白分子的熒光強(qiáng)度，[Q]為溶液中猝滅劑的濃度，K為可被猝滅劑所接近的分子發(fā)色基團(tuán)的Stern-Volmer常數(shù)，KSV為猝滅劑的猝滅常數(shù)，其倒數(shù)1/KSV等于熒光物質(zhì)50%熒光被猝滅時(shí)猝滅劑的濃度，fm為分子中可被猝滅劑接近的發(fā)色基團(tuán)占總熒光發(fā)色基團(tuán)的百分比。

在不同脲濃度下，取猝滅劑丙烯酰胺和KI對(duì)芽孢桿菌α-淀粉酶內(nèi)源熒光猝滅圖譜最大發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度，如公式(1)和(2)所示，分別以F0/F對(duì)[Q]和F0/(F0-F)對(duì)1/[Q]進(jìn)行Stern-Volmer線性分析，從斜率和截距即可獲得1/KSV和fm。表1總結(jié)了不同脲濃度下的Stern-Volmer線性分析參數(shù)KSV和fm。表1結(jié)果表明：(1)當(dāng)溶液中存在猝滅劑丙烯酰胺或KI時(shí)，相比天然態(tài)酶分子的線性分析參數(shù)，誘導(dǎo)劑脲存在時(shí)且隨脲濃度的增大KSV和fm均增大。這說(shuō)明，在脲存在時(shí)α-淀粉酶分子中的色氨酸殘基會(huì)逐漸暴露出來(lái)，且隨著溶液中脲濃度的增大和α-淀粉酶分子去折疊程度的加深，丙烯酰胺和KI對(duì)α-淀粉酶的猝滅效率提高，猝滅程度增強(qiáng)；(2)當(dāng)溶液中不存在脲時(shí)，酶分子中有14個(gè)色氨酸殘基會(huì)被丙烯酰胺猝滅，其猝滅率約為83%；而當(dāng)溶液中脲濃度為4.0和8.0 mol/L時(shí)，α-淀粉酶分子中被丙烯酰胺猝滅的色氨酸殘基數(shù)均為15個(gè)，其猝滅率分別約為88%、90%。而該酶分子中共有17個(gè)色氨酸殘基。這表明當(dāng)溶液中脲濃度為8.0 mol/L時(shí)，該酶分子中仍有丙烯酰胺分子無(wú)法接近的區(qū)域；(3)當(dāng)溶液中存在猝滅劑KI時(shí)，隨著溶液中脲濃度的增大，α-淀粉酶分子中能夠被KI猝滅的色氨酸殘基數(shù)也逐漸增多，猝滅程度逐漸增強(qiáng)。這表明隨著溶液中變性劑脲濃度的增加，α-淀粉酶分子的去折疊程度也在加深。

丙烯酰胺為不帶電荷的非極性猝滅劑，既可能猝滅蛋白分子表面基團(tuán)的熒光，也可能猝滅深埋于蛋白分子內(nèi)部基團(tuán)的熒光[23,24]。而KI為陰離子猝滅劑，因此，它只能猝滅位于蛋白分子表面或接近于分子表面的極性環(huán)境中的熒光基團(tuán)[24,25]。通過(guò)比較表1中同一脲濃度下可被丙烯酰胺和KI猝滅的α-淀粉酶分子中的色氨酸殘基數(shù)，我們認(rèn)為KI在研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變和部分折疊中間體方面效果更好。

表1 丙烯酰胺和KI對(duì)不同濃度脲誘導(dǎo)的變性α -淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm Table 1 Fluorescence quenching parameters KSV and fm of Bacillus α -amylase by acrylamide and KI in the denaturation solutions containing different concentrations of urea

2.6 重折疊過(guò)程的熒光猝滅

表2總結(jié)了丙烯酰胺和KI對(duì)脲誘導(dǎo)的不同程度重折疊α-淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm。從表2可看出，在脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的重折疊過(guò)程中，隨著溶液中脲濃度的降低，參數(shù)KSV和fm均逐漸減小，說(shuō)明隨著溶液中脲濃度的降低，丙烯酰胺和碘化鉀對(duì)酶分子的猝滅效率降低，猝滅程度減弱。該結(jié)果表明在脲誘導(dǎo)的酶分子重折疊過(guò)程中，隨著復(fù)性液中脲濃度的逐漸降低，酶分子中的色氨酸殘基逐漸被包埋進(jìn)分子內(nèi)部。

表2 丙烯酰胺和KI對(duì)不同濃度脲誘導(dǎo)的復(fù)性α -淀粉酶分子內(nèi)源熒光猝滅的猝滅參數(shù)KSV和fm

圖8 不同濃度脲和鹽酸胍下α -淀粉酶去折疊過(guò)程的殘余活性率Fig.8 Residual activity rates of Bacillus α -amylase under different concentrations of urea and guanidine hydrochloride○:urea solution;△:guanidine hydrochloride solution.

比較表1和表2我們發(fā)現(xiàn)，在α-淀粉酶去折疊和重折疊過(guò)程中，無(wú)論猝滅劑為丙烯酰胺或KI，當(dāng)脲誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性液和復(fù)性液對(duì)應(yīng)的脲濃度相同時(shí)，猝滅劑對(duì)酶分子的猝滅參數(shù)KSV和fm基本一致。進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)脲誘導(dǎo)α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程可能是互為可逆過(guò)程的推測(cè)。此外，對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的內(nèi)源熒光猝滅也進(jìn)行了研究，并將結(jié)果與它們的去折疊過(guò)程[18]相比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)論猝滅劑為丙烯酰胺或KI，當(dāng)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子變性液和復(fù)性液對(duì)應(yīng)的鹽酸胍濃度相同時(shí)，猝滅劑對(duì)酶分子的猝滅參數(shù)KSV和fm基本一致。這也進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程是互為可逆過(guò)程的推測(cè)。

2.7 去折疊和重折疊過(guò)程的生物活性

圖8給出了脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子去折疊過(guò)程中的殘余活性率(r)。由圖8可知，隨著變性劑濃度的增加，α-淀粉酶分子的殘余活性均逐漸降低，且在鹽酸胍中下降的更快。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子重折疊過(guò)程的復(fù)性率圖線幾乎與其去折疊過(guò)程的殘余活性率圖線重合。這也進(jìn)一步證實(shí)了前面有關(guān)脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程分別是一個(gè)可逆過(guò)程的推測(cè)。

3 結(jié)論

本研究及我們之前的工作表明，在脲和鹽酸胍誘導(dǎo)的淀粉液化芽孢桿菌α-淀粉酶分子的去折疊和重折疊過(guò)程中，芽孢桿菌α-淀粉酶分子始終以單分子形式存在，且分別在4.0 mol/L脲和1.0 mol/L鹽酸胍溶液中存在一個(gè)部分折疊中間態(tài)，它們的去折疊和重折疊過(guò)程均是可逆的三態(tài)過(guò)程。