隗予榮， 明瑞杰， 王升富， 袁 荃*

(1.有機功能分子合成與應(yīng)用教育部重點實驗室，湖北大學化學化工學院，湖北武漢 430062；2.生物醫(yī)學分析教育部重點實驗室，武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢430072)

心血管疾病具有高患病率、高致殘率、高死亡率以及高醫(yī)療風險等特點已經(jīng)成為重大公共衛(wèi)生問題。心血管疾病患者容易發(fā)生栓塞和卒中等危險，而抗凝劑的溶栓和預(yù)防血栓等作用對心血管疾病的治療起到了非常重要的作用。凝血酶可促進血液凝固，在血管損傷、凝血和血小板激活中起到了紐帶的作用。直接抑制凝血酶活性的抗凝劑可以避免其他抗凝劑起效慢以及諸多并發(fā)癥等缺陷[1]。核酸適配體是一種具有很好應(yīng)用前景的抗凝劑[2]，且部分核酸適配體已經(jīng)進入臨床試驗[3]。凝血酶的一種即由15個堿基組成的核酸適配體(TBA15)可以與其活性位點Ⅰ結(jié)合，抑制其活性，因而廣泛用于心血管疾病的治療。但TBA15與凝血酶的親和力有限[4],不僅抑制效果不夠理想，而且目前還缺少針對TBA15的解毒劑。

DNA納米技術(shù)是一種基于DNA的理化特性為原理而構(gòu)建的新型納米技術(shù)，在生物物理學、生物傳感等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[5]。鄰近表面雜交技術(shù)是Landegren等開發(fā)的一種特殊DNA納米技術(shù)[6]，他們發(fā)現(xiàn)一對核酸適配體在識別同一靶標物時，兩條核酸適配體與靶標物三者之間往往趨向于形成一種穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。Le等利用這種技術(shù)實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的超靈敏檢測[7]。據(jù)文獻報道[8]，凝血酶的另一種即由29個堿基組成的核酸適配體(TBA29)與凝血酶結(jié)合的親和力較高，Kd值約為0.5 nmol/L，由于該適配體是與凝血酶的第Ⅱ個活性位點結(jié)合，所以沒有抑制效果，但是可以基于鄰近表面雜交技術(shù)使TBA15、TBA29和凝血酶構(gòu)建成一種穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)來提高TBA15與凝血酶的親和性，加強抑制效果，從而增強心血管疾病的治療效果。

貴金屬的局部表面等離子體共振效應(yīng)是金屬表面自由電子在電磁場的驅(qū)動下表面電荷發(fā)生聚集和振蕩的過程，該過程可以高效的將光能轉(zhuǎn)化為熱能[9]。金納米棒基于這種性質(zhì)可以產(chǎn)生良好光熱效應(yīng)[10]。TBA15與凝血酶結(jié)合時呈現(xiàn)G -四鏈體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)依賴于G堿基的氫鍵作用而穩(wěn)定存在，但是氫鍵易受溫度升高而破壞[11]，因此可以通過金納米棒的光熱效應(yīng)來破壞TBA15的空間結(jié)構(gòu)從而解除抑制作用來達到解毒的目的。此外，閉環(huán)結(jié)構(gòu)中的兩核酸適配體的部分雙鏈互補也是通過氫鍵來維持，光熱效應(yīng)可以使整個閉環(huán)結(jié)構(gòu)解體，凝血酶的活性恢復(fù)并伴隨解毒過程的進行。

圖1 凝血酶活性被閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制和近紅外光釋放的原理圖Fig.1 Schematic representation of thrombin activity inhibition by the closed-loop structure and release by NIR light stimulation

本文基于鄰近表面雜交技術(shù)構(gòu)建了一個穩(wěn)定的雙核酸適配體凝血酶的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。TBA15和TBA29同時與凝血酶的不同結(jié)合位點結(jié)合，二者末端的部分序列互補配對而使整體形成一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)，可以大大增強TBA15與凝血酶的親和作用，提高抑制效果。由于金納米棒的光熱效應(yīng)，近紅外光的照射可以使這種閉環(huán)結(jié)構(gòu)解體，凝血酶的活性得以恢復(fù)，從而作為針對TBA15的解毒劑(圖1)。纖維蛋白原聚合為纖維蛋白的散射變化以及形成的纖維蛋白的掃描電子顯微鏡(SEM)的照片均顯示該閉環(huán)結(jié)構(gòu)較單獨的TBA15對凝血酶活性的抑制效果更顯著，同時也證明了近紅外光刺激下酶活性恢復(fù)的可能性。人血清凝血時間測試進一步證明該方法具有非常好的應(yīng)用前景。此外，模擬透析實驗結(jié)果表明該方法還可用于除心血管疾病治療的其它疾病輔助治療中，例如急性腎功能衰竭病人血液濾過治療過程中的抗凝與解毒。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)(日本，JEOL公司)；UV-2500紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；納米粒度及Zeta電位分析儀(英國，Malvern 公司)；808 nm紅外激光器(陜西凱斯特電子科技有限公司)；F-4600熒光光譜儀(日本，日立公司)；ACL TOP 700全自動凝血分析儀(美國)；MP-2003注射泵(上海雷恩醫(yī)療器械有限公司)；JSM-6510掃描電鏡(SEM,日本)。

纖維蛋白原購于Sigma Aldrich 公司；人α-凝血酶購于Haematologic Technologies 公司；300 nm羧基修飾的磁球購于武漢珈源量子點技術(shù)開發(fā)有限公司。凝血酶核酸適配體由ABI 3400 DNA/RNA合成儀合成(美國Applied Biosystems 公司)，并采用高效液相色譜純化。HAuCl4·3H2O，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，均購于阿拉丁。其他試劑均為分析純。實驗用水均為高純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)。

核酸適配體序列分別為：TBA15:5′-GGT TGG TGT GGT TGG TTT TTT GTC GTG GGT CT TTTT-SH-3′;TBA29:5′-ACC CAC GAC TTT TTT AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3′。

1.2 金納米棒(Au NPs)的制備

金納米棒的制備方法采用種子生長法[12]。取9.75 mL 0.1 mol/L的CTAB溶液，向其中加入0.25 mL 0.01 mol/L HAuCl4以及新配制的10 mmol/L NaBH4600 μL，混合后室溫劇烈攪拌10 min作為種子溶液。另外取一支離心管，加入38 mL 0.1 mol/L CTAB 溶液、2 mL 0.01 mol/L HAuCl4和0.6 mL 0.01 mol/L AgNO3，混合后向其中加入0.21 mL新配制的0.1 mol/L抗壞血酸溶液，劇烈搖晃至無色作為母液。取0.12 mL的種子溶液加入到母液中，并在溫度37 ℃反應(yīng)過夜，制備好的金納米棒溶液離心并用水洗三次以除去CTAB，沉淀最后分散在水中。

1.3 磁球/金納米棒(MB/Au NPs)納米材料的制備

取10 mg/mL羧基修飾的磁球40 μL，加入到1.5 mL的0.1 mol/L MES溶液(pH=6.0)中。然后加入8 mg的EDC和1.2 mg的NHS,溶液在溫度37 ℃活化反應(yīng)15 min?；罨蟮拇徘蛴么盆F吸到底部，移去上清液，再將溶液分散在1 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，含150 mmol/L NaCl)中，加入1 mmol/L 400 μL的半胱氨酸于37 ℃反應(yīng)24 h，得到的半胱氨酸修飾的磁球，用水洗滌三次，分散在1 mL的Au NPs溶液中，并反應(yīng)24 h。最后使用磁鐵分離，將沉淀分散在1 mL的PBS中。

1.4 構(gòu)建磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)

取400 μL溶解在生理緩沖液(Tris-HCl緩沖液，25 mmol/L,pH=7.4,150 mmol/L NaCl,5.0 mmol/L KCl,1.0 mmol/L MgCl2,1.0 mmol/L CaCl2)的磁球/金納米棒溶液，加入10 μL 1 μmol/L的TBA15溶液反應(yīng)12 h，反應(yīng)后離心洗滌并分散在400 μL的生理緩沖液中，然后向其中加入2 μL 1 μmol/L 的TBA29和1 μL 0.1 μmol/L的凝血酶溶液，混合液搖床反應(yīng)2 h。

1.5 不同溫度處理磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)

取400 μL的磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)溶液，分別在溫度45、50、55、60、65 ℃處理10 min，立刻用磁鐵處理，取200 μL的上清液，0 ℃預(yù)處理20 min，再向其中加入10 mg/mL 5 μL纖維蛋白原，并立刻在熒光光譜儀上測散射信號的變化。

1.6 光熱處理磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)

取400 μL的磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)溶液于1 mL滅菌的離心管中，用808 nm的激光器垂直照射離心管，選擇一定的功率使溶液溫度穩(wěn)定在55 ℃并保持10 min，用磁鐵置于離心管底部處理溶液，待上清液澄清后取出200 μL上清液,0 ℃預(yù)處理20 min，加入5 μL 10 mg/mL纖維蛋白原溶液，在熒光光譜儀上測散射信號的變化。

1.7 人血清凝血時間測試

向1 mL生理緩沖液中依次加入25 nmol/L凝血酶、250 nmol/L TBA15和400 μL的磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)溶液，混合均勻后放置在全自動凝血儀上。取健康志愿者血液3 mL，加入333 μL 0.109 mol/L枸櫞酸鈉溶液后，于3 000 r/min離心3 min以分離血細胞。將處理后的血清放在凝血儀的測試架上進行測量，記錄凝血時間。

1.8 模擬透析

在注射泵上接一次性醫(yī)用輸液管來模擬透析過程中的血液管道，利用注射泵推動溶液流動來模擬血液流動。向輸液管中加入含有25 nmol/L凝血酶、1 mg/mL MB/Au-TBA15和250 nmol/L TBA29的混合溶液，調(diào)節(jié)緩沖液的流速為1 mL/h，溶液流動30 min后，取流出200 μL的溶液，加入5 μL 10 mg/mL纖維蛋白原溶液，監(jiān)測散射變化。溶液取出以后在出液端安裝一個永磁鐵，使用808 nm的激光器照射永磁鐵前10 cm的溶液使溫度上升至55 ℃并保持10 min，溶液流經(jīng)磁鐵后溶液中部分磁性納米顆粒被吸附，收集處理后的溶液，同樣取200 μL，加入5 μL 10 mg/mL纖維蛋白原溶液，監(jiān)測散射信號的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米棒的合成與磁球/金納米棒復(fù)合材料的表征

圖2(a)是金納米棒連接到磁球表面的方法示意圖。以半胱氨酸作為連接劑，羧基修飾的磁球通過酰胺鍵與半胱氨酸的氨基相連接，金納米棒通過金硫鍵與半胱氨酸上的巰基相連，從而使金納米棒修飾在磁球表面。圖2(b)為磁球/金納米棒的透射電鏡(TEM)圖，從圖中可以看出，金納米棒尺寸均一，平均長度為37 nm并且均勻修飾在磁球表面；圖2(c)顯示金納米棒紫外吸收光譜的最大吸收值在800 nm左右。圖2(d)為磁球/金納米棒制備及后續(xù)TBA15修飾過程的Zeta電位表征圖，從圖中可以看出，羧基修飾的磁球連接半胱氨酸后電位值由-17.9 mV變?yōu)?32.1 mV。當CTAB穩(wěn)定的金納米棒連接到磁球上面后整體表面的電位值為17.6 mV，進一步修飾上TBA15后，MB/Au-TBA15的電位值變?yōu)?20.4 mV。這些電位的變化表明金納米棒成功修飾在磁球表面，TBA15也成功連接在金納米棒表面。

圖2 (a)金納米棒修飾在磁球表面的示意圖;(b)磁球/金納米棒納米顆粒的透射電鏡圖(標尺:100 nm);(c)金納米棒的紫外吸收圖譜;(d)磁球、半胱氨酸修飾的磁球、磁球/金納米棒、TBA15修飾的磁球/金納米棒的Zeta 電位;(e)不同功率的近紅外光照射下磁球/金納米棒溶液的溫度變化曲線Fig.2 (a) Schematic illustration of MB NPs functionalized with AuNRs；(b) TEM image of MB/Au NPs(Scale bar,100 nm;(c) Absorption spectrum of AuNPs;(d) Zeta potentials of MB,MB-Cys,MB/Au and MB/Au-TBA15;(e) Temperature rise traces of MB/Au NPs solution under NIR light irradiation with different power

2.2 磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)對凝血酶活性的抑制效果

圖3 未被抑制的凝血酶(a：對照組)和被TBA29(b)、 TBA15(c)以及MB/Au-閉環(huán)結(jié)構(gòu)(d)抑制后的凝血酶催化纖維蛋白原聚合的實時監(jiān)測散射圖譜Fig.3 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution treated with uninhibited thrombin(a:Control),thrombin inhibited by TBA29(b),by TBA15(c) and the MB/Au-closed-loop structure(d)

凝血酶可以催化可溶性的纖維蛋白原水解為不溶于水的纖維蛋白，纖維蛋白原對光的散射程度小，但聚合后的纖維蛋白原對光有很強的散射作用，散射程度變化越快表明凝血酶的酶活性越高。TBA15與TBA29分別與凝血酶的不同結(jié)合位點結(jié)合[13],兩種核酸適配體末端部分互補配對可以形成一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)可以增強TBA15與凝血酶的結(jié)合作用，從而增強對凝血酶的抑制效果。圖3中曲線a、b、c、d分別是未被抑制的凝血酶以及TBA29、TBA15、磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶催化纖維蛋白原聚合的散射信號變化曲線。曲線b中散射強度增加的速率與曲線a類似，信號增加都很快，表明TBA29對凝血酶活性沒有抑制效果，這與文獻報道[8]的結(jié)果一致。曲線c中散射強度的增加速率比曲線a和b慢，表明TBA15對凝血酶活性有一定抑制效果，曲線c和曲線d散射信號增加速率對比清楚地顯示閉環(huán)結(jié)構(gòu)對凝血酶的活性抑制效果要遠遠強于TBA15，表明該閉環(huán)結(jié)構(gòu)是比TBA15更加優(yōu)越的潛在治療心血管疾病的抗凝劑。

實驗進一步利用掃描電子顯微鏡對比了TBA15和磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)對凝血酶活性的抑制效果。圖4(a)是未被抑制的凝血酶催化纖維蛋白形成的纖維蛋白的掃描電子顯微鏡照片，圖中顯示出大面積的網(wǎng)狀纖維蛋白。圖4(b)是TBA15抑制的凝血酶處理后得到的結(jié)果，圖中大量絮狀纖維蛋白的產(chǎn)生表明TBA15對凝血酶活性有一定的抑制作用。圖4(c)是磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶處理后的結(jié)果，圖中僅可以看到大量的點狀蛋白，幾乎沒有纖維狀，表明凝血酶的活性被顯著抑制了，而且磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)對凝血酶活性的抑制效果遠遠強于TBA15，這與前面的散射實驗的結(jié)果是一致的。

圖4 (a)未被抑制的凝血酶催化的纖維蛋白原聚合的掃描電鏡(SEM)圖；(b)TBA15抑制的凝血酶催化的纖維蛋白原聚合的SEM；(c)磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶催化的纖維蛋白原聚合的SEM圖Fig.4 (a) SEM of fibrinogen solution with addition of uninhibited thrombin;(b) SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by TBA15;(c) SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by the MB/Au-closed-loop structure

2.3 不同溫度處理磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)后釋放出的凝血酶活性研究

圖5是不同溫度處理閉環(huán)結(jié)構(gòu)后恢復(fù)的凝血酶催化纖維蛋白原聚合過程的實時散射圖。由圖中可以看出，45 ℃處理后得到的凝血酶催化纖維蛋白原聚合的散射曲線相對于閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶作用的曲線幾乎沒有變化，表明45 ℃不足以破壞閉環(huán)結(jié)構(gòu)。50 ℃處理后凝血酶的活性顯著增加。55 ℃處理后得到的凝血酶活性進一步增加，然而當溫度超過55 ℃時，得到的凝血酶活性又開始呈下降趨勢，這可能是溫度過高對酶活性不利引起的。因此，55 ℃處理閉環(huán)結(jié)構(gòu)能最大程度恢復(fù)閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶活性。形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)會使核酸適配體與底物形成的復(fù)合物的熔點升高[14]，有時甚至可以升高30 ℃。TBA15與凝血酶復(fù)合物的熔點是46.5 ℃[15]，形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)后到達55 ℃左右，這與文獻報道一致。

2.4 近紅外光控制的凝血酶活性恢復(fù)研究

圖6中曲線a和c分別是未被抑制和被閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶催化纖維蛋白原聚合的散射光譜圖，圖中c的散射變化較a慢，說明凝血酶活性被抑制了。圖6中曲線b為近紅外光照射后的凝血酶處理的結(jié)果，溶液散射強度迅速增加到最大值且斜率與未被抑制凝血酶(圖6曲線a)相似，這表明閉環(huán)結(jié)構(gòu)的抑制作用在近紅外光刺激下被破壞，酶活性得以恢復(fù)。上述結(jié)果表明近紅外光可以作為針對這種閉環(huán)結(jié)構(gòu)抗凝劑的高效解毒劑。同樣，我們利用SEM研究了這一現(xiàn)象。圖7(a)、7(b)分別為近紅外光刺激閉環(huán)結(jié)構(gòu)前后的凝血酶催化的纖維蛋白原轉(zhuǎn)換后的纖維蛋白的SEM照片。圖7(a)中可以看到大量點狀蛋白，少量絮狀纖維蛋白；而圖7(b)中近紅外光處理后有大面積絮狀纖維蛋白產(chǎn)生，也表明近紅外刺激后酶活性得到了有效的恢復(fù)。

圖5 磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)不同溫度處理后釋放抑制的凝血酶催化纖維蛋白原聚合過程的散射圖Fig.5 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin recovered at different temperaturesa:Control;b:inhibited thrombin by the MB/Au-Closed-loop structure;c:45 ℃;d:50 ℃;e,55 ℃;f,60°C;g:65 ℃.

圖6 磁球/金納米棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的以及光熱釋放的凝血酶催化纖維蛋白原聚合過程的散射圖Fig.6 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solutions with addition of thrombin inhibited by the MB/Au-Closed-loop structure and thrombin recovered by photo liberation

圖7 (a) 磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶催化纖維蛋白原聚合后的掃描電鏡(SEM)圖；(b) 光熱處理閉環(huán)結(jié)構(gòu)后釋放的凝血酶催化纖維蛋白原聚合的SEMFig.7 (a)SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by the MB/Au-Closed-loop structure;(b) SEM of fibrinogen solution with addition of thrombin recovered by photo liberation

2.5 人血清凝血時間測試

正常人凝血時間的范圍是9～13 s；由于血液中具有一定的抗凝物質(zhì)和纖維蛋白原，通過向同一批血液中加入一定濃度的凝血酶測定凝血時間也可以反映凝血酶的活性，凝血時間越長表明酶活性越低。如表1中所示，加入TBA15抑制的凝血酶測血清的凝血時間為12.6 s，稍微比未被抑制的凝血酶測的凝血時間9.7 s長。而磁球/金棒-閉環(huán)結(jié)構(gòu)抑制的凝血酶測血清的凝血時間長達43.4 s，是未被抑制的凝血酶的4倍多，表明閉環(huán)結(jié)構(gòu)能顯著抑制凝血酶的活性。近紅外光處理后恢復(fù)的凝血時間明顯降低到13.9 s，表明凝血酶活性得到了有效的恢復(fù)。以上結(jié)果表明我們開發(fā)的抗凝/解毒方法可以應(yīng)用到實際樣品中，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

表1 凝血時間

2.6 模擬透析實驗

連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過是重癥監(jiān)護室(ICU)常用的重要治療方法之一，可用于急性腎功能衰竭、全身炎癥反應(yīng)綜合征、多臟器功能衰竭等疾病的救治，在這些血液濾過治療中同樣也需要使用抗凝劑和解毒劑。我們進一步探索了上述靶向凝血酶的調(diào)控方法在血液濾過治療中的應(yīng)用。圖8(a)是設(shè)計的透析示意圖，TBA15修飾的磁球/金納米棒以及TBA29被加入到回路中(第1步)，在到達透析器之前與凝血酶形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)抗凝作用(第2步)。溶液流過透析器以后使用近紅外光處理(第3步)，可以破壞閉環(huán)結(jié)構(gòu)(第4步)并釋放出凝血酶，凝血酶的正常生理活性得到恢復(fù)并隨即進入體內(nèi)，而磁球/金納米棒復(fù)合物則可以通過磁鐵收集(第5步)。如圖8(b)所示，第1步之前未被抑制的凝血酶顯示出很快的反應(yīng)動力學表明凝血酶活性很高，當凝血酶被困于閉環(huán)結(jié)構(gòu)中，散射強度增加很緩慢而且沒有出現(xiàn)突躍。近紅外光處理以后，凝血酶的活性得以恢復(fù)，散射曲線能夠快速達到平臺。這些結(jié)果表明，這種抗凝/解凝方法有望應(yīng)用于急性腎功能衰竭等疾病的血液濾過治療中。

圖8 (a)人工模擬透析示意圖；(b)透析過程中凝血酶活性抑制與恢復(fù)過程中凝血酶催化纖維蛋白原聚合的實時監(jiān)測散射圖Fig.8 (a)Schematic representation of the artificial dialysis circuit;(b) Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution with addition of thrombin solutions from different steps in the dialysis circuit

3 結(jié)論

本研究基于鄰近表面雜交技術(shù)，利用凝血酶的兩種核酸適配體與凝血酶構(gòu)建了一種穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，增強了適配體對凝血酶的活性抑制效果。在近紅外光的刺激下，由于金納米棒的光熱效應(yīng)，溶液的溫度升高使閉環(huán)結(jié)構(gòu)破壞并釋放出凝血酶，從而恢復(fù)酶活性。通過實時監(jiān)測凝血酶催化纖維蛋白原聚合成纖維蛋白過程中溶液散射強度的變化以及掃描電子顯微鏡等手段研究了閉環(huán)結(jié)構(gòu)對酶的抑制以及近紅外光處理的酶活性恢復(fù)效果。人血清凝血時間測試表明該抗凝/解毒方法可以應(yīng)用到實際樣品中，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。此外，我們還進行了模擬透析實驗，結(jié)果表明這種抗凝/解毒方法過程有望應(yīng)用于急性腎功能衰竭領(lǐng)域等疾病的血液濾過治療中。該靶向凝血酶的抗凝/解毒方法不僅有望用于臨床心血管疾病治療中，還為急性腎功能衰竭等疾病的血液濾過治療提供新的輔助治療手段。