胡建燃，李 平，秦路鵬，萬田田，劉志芳，方玉潔

(長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系, 山西長治 046011)

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恒山黃芪和寧夏枸杞的多糖體外抗氧化活性比較研究

胡建燃，李 平*，秦路鵬，萬田田，劉志芳，方玉潔

(長治學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系, 山西長治 046011)

以恒山黃芪和寧夏枸杞為材料，采用超聲波法提取其多糖成分，比較分析恒山黃芪多糖、寧夏枸杞多糖以及二者復(fù)合多糖的抗氧化活性，為開發(fā)新的天然抗氧化劑提供依據(jù)。結(jié)果顯示：(1)恒山黃芪多糖的總抗氧化能力[T-AOC =(0.67±0.12) U/mg]和超氧陰離子自由基清除能力(EC50= 2.34 mg/mL)均高于寧夏枸杞多糖[T-AOC =(0.52±0.07) U/mg，EC50= 4.28 mg/mL]，而恒山黃芪多糖的羥自由基清除能力(EC50= 1.36 mg/mL)則低于寧夏枸杞多糖(EC50= 0.98 mg/mL)。(2)在相同濃度下，二者按照1∶1比例配成的復(fù)合多糖總抗氧化能力[T-AOC=(0.79±0.02) U/mg]、羥自由基清除能力(EC50=0.84 mg/mL)、超氧陰離子自由基清除能力(EC50=1.37 mg/mL)均高于單種多糖。(3)恒山黃芪多糖、寧夏枸杞多糖以及二者復(fù)合多糖的抗氧化能力均與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。研究表明，恒山黃芪多糖具有較好的抗氧化活性，是具有開發(fā)潛力的天然抗氧化物質(zhì)，且恒山黃芪多糖與寧夏枸杞多糖復(fù)合配伍后具有協(xié)同效應(yīng)，抗氧化活性增強。為開發(fā)新的天然抗氧化劑提供參考。

恒山黃芪；寧夏枸杞；復(fù)合多糖；抗氧化；羥自由基；超氧陰離子自由基

黃芪，原名黃耆，是豆科植物蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge) Hsiao]和膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]的干燥根[1]，具有扶正固表、補氣升陽等功效，是傳統(tǒng)的名貴中藥之一。而產(chǎn)于北岳恒山山脈的恒山黃芪，因其歷史悠久、品質(zhì)上乘、藥性強享譽國內(nèi)外。自宋代以后，恒山黃芪始終被醫(yī)家視為正宗和上品， 故有“正北芪”之稱[2]。 黃芪的主要成分主要含有多糖、皂苷、氨基酸、黃酮及各種微量元素等[3]。黃芪多糖作為黃芪的主要有效成分，具有抗衰老，抗腫瘤，調(diào)節(jié)血糖，抗病毒抗菌等作用[4-6]。

枸杞，是茄科枸杞屬 (LyciumL.)的灌木或蔓生灌木，其果實為卵圓形紅色或暗紅色漿果，營養(yǎng)豐富，食藥兩用[7]，有養(yǎng)肝明目、祛風(fēng)和滋腎補髓的功效，是傳統(tǒng)的補益中藥?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載“枸杞久服,堅筋骨,輕身不老”，將枸杞列入上品。枸杞在中國有7個種，3個變種，大多分布于華北、西北地區(qū)[8]。其中，寧夏枸杞最負盛名，枸杞多糖是枸杞的主要活性成分之一，具有增強免疫力，抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、降血壓、降血脂等多方面的藥理作用[9-12]。

氧自由基是人體內(nèi)存在的最主要的自由基，能引起生物大分子如核酸，蛋白質(zhì)，多糖等的損傷，引發(fā)多種疾病，如癌癥、心臟病、老年癡呆癥、肝腎損傷等。此外，氧自由基還與衰老有關(guān)[13]。適量的補充抗氧化食品或藥品是清除人體自由基、預(yù)防疾病、延緩衰老的最佳方法[14]。近年來，天然抗氧化物質(zhì)的研究開發(fā)成為熱點，目前，從中藥材提取活性多糖、黃酮、多酚類、維生素類等成分來清除氧自由基，抑制氧化應(yīng)激受到廣泛關(guān)注[15-16]。

目前，對恒山黃芪的研究主要集中在有效成分的提取及人工栽培技術(shù)方面[17-20]，對其抗氧化活性的檢測少見報道，本文利用超聲波法對恒山黃芪和寧夏枸杞進行多糖提取，以恒山黃芪多糖和寧夏枸杞多糖及二者復(fù)合多糖為實驗對象，對不同濃度梯度的多糖進行體外抗氧化能力研究，包括羥自由基的清除能力、超氧陰離子自由基清除能力以及總抗氧化能力。以期為恒山黃芪資源的進一步發(fā)掘以及抗氧化食品或藥品的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

本實驗用恒山黃芪來源于蒙古黃芪，取自山西省渾源縣黃芪基地。寧夏枸杞，購自長治萬民大藥房，羥自由基測試盒、超氧陰離子自由基測試盒、總抗氧化能力測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

無水乙醇、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、硫酸、氯仿、正丁醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為雙蒸水。

1.2 儀 器

ND 2000微量分光光度計(上海市精密科學(xué)儀器有限公司)，DFY-300高速萬能粉碎機(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)，BSA 124S-CW電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，KQ-250醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，5805臺式高速離心機(北京博瑞祥騰科技有限公司)，RE-5ZAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 方 法

1.3.1 超聲波法提取黃芪、枸杞多糖 將黃芪和枸杞放入燒杯中，于55 ℃烘箱中干燥后，用粉碎機進行粉碎，過30目篩。分別取20 g恒山黃芪和寧夏枸杞粉末，各加入300 mL 80%乙醇回流提取2次，每次3 h，濾去乙醇，收集濾渣，晾干。藥渣加入200 mL水，置于超聲波清洗儀中，40 ℃恒溫超聲波提取2 h，過濾；重復(fù)提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至100 mL，加入3倍體積的95%乙醇，靜置過夜，4 000 r/min離心20 min，沉淀用50 mL蒸餾水溶解，得到多糖水溶液。采用Sevag法脫蛋白，在多糖水溶液中加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，振蕩30 min，離心，取上清液，重復(fù)8次。隨后將上清液裝入透析袋內(nèi)透析24 h，然后加入3倍體積95%乙醇，4 000 r/min離心20 min，得沉淀，固態(tài)物用95%乙醇，無水乙醇，依次洗滌，于50 ℃恒溫干燥24 h，即得黃芪多糖和枸杞多糖。

1.3.2 制備多糖樣品溶液 精確稱取0.5 g多糖用蒸餾水定容到50 mL容量瓶中作為母液，得到的母液濃度10 mg/mL，并將母液進行稀釋，配成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、4.0 mg/mL，保存?zhèn)溆?。?fù)合多糖采用2種多糖以1∶1的比例配成與單組分多糖相同的濃度，以供抗氧化能力的測定。

1.3.3 多糖抗氧化能力測定[21]多糖樣品的超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力以及總抗氧化能力檢測采用化學(xué)比色法，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，按照試劑盒說明書進行操作。

(1)總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)測定

配制多糖樣品濃度為5 mg/mL，取0.1 mL 樣品液， 按照試劑盒說明書進行總抗氧化能力測定。以在食品藥品中常用的化學(xué)抗氧化劑水溶性維生素E(Trolox)和2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)作為陽性對照，測定520 nm處的吸光值。定義:在37 ℃時,每分鐘每毫克多糖，使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位。計算公式為:

將計算得到的總抗氧化能力(即T-AOC值)進行兩兩比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，計算P值。統(tǒng)計分析結(jié)果體現(xiàn)在圖1的柱狀圖里的小寫字母a、b和c，字母不同表示兩者之間差異顯著。

(2)羥自由基清除能力測定

將多糖樣品分別用去離子水稀釋成4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2和0.1 mg/mL系列濃度，按試劑盒說明書的步驟進行測定[22]。以化學(xué)抗氧化劑 Trolox、BHT作為陽性對照。羥自由基清除率計算公式：

根據(jù)各樣品不同濃度下羥自由基的清除率，通過擬合計算清除率為50% 時的樣品濃度， 即為樣品對羥自由基清除能力的 EC50值，樣品的EC50值越小，其羥自由基清除能力越強。

(3)超氧陰離子自由基清除能力測定

將多糖樣品分別用去離子水稀釋成 4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2和0.1 mg/mL 系列濃度，按試劑盒說明書的步驟進行測定，測定 550 nm 波長處吸光度值。以化學(xué)抗氧化劑 Trolox和BHT 作為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率計算公式:

根據(jù)各樣品不同濃度下超氧陰離子自由基的清除率， 通過擬合計算清除率為50% 時的樣品濃度， 就是樣品對超氧陰離子自由基清除能力的 EC50值。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用軟件SPSS 13.0對所有試驗數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的總抗氧化能力

將多糖樣品濃度配制成5 mg/mL，檢測黃芪多糖、枸杞多糖以及復(fù)合多糖的總抗氧化能力，實驗結(jié)果如圖1所示。恒山黃芪的總抗氧化能力為(0.67±0.12) U/mg，寧夏枸杞的總抗氧化活性為(0.52±0.07) U/mg，恒山黃芪多糖總抗氧化能力顯著(P<0.05)高于枸杞多糖和化學(xué)抗氧化劑BHT。復(fù)合多糖的總抗氧化能力為(0.79±0.02) U/mg，高于單一組分的多糖，同時高于化學(xué)抗氧化劑BHT[(0.41±0.08) U/mg]，低于Trolox[(3.56±0.33) U/mg]，說明兩種多糖都具有較強的總抗氧化能力，而且復(fù)配后的多糖其總抗氧化能力提高。

A.黃芪多糖； B.枸杞多糖；C. 復(fù)合多糖(枸杞多糖∶黃芪多糖=1∶1)；D. 2,6-二叔丁基對甲酚；E. 水溶性維生素E；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同圖1 不同來源多糖的總抗氧化能力A. Astragalus polysaccharides； B. Lycium barbarum polysaccharides；C. Compound polysaccharides(Lycium barbarum polysaccharides∶Astragalus polysaccharides=1∶1)；D. BHT；E. Trolox；Different letters mean significant difference among different samples(P<0.05).The same as belowFig.1 The total antioxidant capacity (T-AOC) of polysaccharides

2.2 多糖的羥自由基清除能力

由圖2可知，黃芪多糖和枸杞多糖以及兩者的復(fù)合多糖對羥自由基的清除能力都表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，即隨著樣品濃度增加，羥自由基清除能力隨之增加。計算各樣品的EC50值，結(jié)果見表1。EC50值越高，則樣品的羥自由基清除能力越弱。由表1可知，各樣品對羥自由基的EC50值低于化學(xué)抗氧化劑Trolox，說明多糖具有羥自由基清除能力。其中，枸杞和黃芪的EC50值分別為0.98 mg/mL和1.36 mg/mL，表明枸杞的羥自由基清除能力強于黃芪。復(fù)合多糖的EC50值是0.84 mg/mL，低于黃芪多糖和枸杞多糖。這說明，黃芪和枸杞按照1∶1的劑量配伍后，清除羥自由基的能力表現(xiàn)出正協(xié)同效應(yīng)。

2.3 多糖的超氧陰離子自由基清除能力

將黃芪多糖、枸杞多糖以及復(fù)合多糖配成一定濃度梯度后， 檢測其超氧陰離子自由基清除能力， 結(jié)果如圖3所示。

圖3中曲線顯示，各多糖樣品對超氧陰離子自由基均具有一定的清除效果，且其清除能力與作用濃度呈量效關(guān)系。依照不同濃度下各個樣品的清除率，計算各樣品對超氧陰離子自由基清除的EC50值，結(jié)果如表2所示 。

圖2 不同濃度多糖對羥自由基清除能力的影響Fig.2 Scavenging activities of the polysaccharides on hydroxyl radicals

多糖PolysaccharideEC50/(mg/mL)枸杞多糖L.barbarumpolysaccharides0.98黃芪多糖Astragaluspolysaccharides1.36枸杞多糖∶黃芪多糖(1∶1)L.barbarum/Hengs-hanAstragalus(1∶1)0.842,6-二叔丁基對甲酚BHT0.48水溶性維生素E Trolox1.70

由表中數(shù)據(jù)可知，恒山黃芪超氧陰離子自由基清除EC50值低于寧夏枸杞，并且復(fù)合多糖的EC50值顯著低于2種單組分多糖，這說明恒山黃芪的超氧陰離子自由基清除能力比寧夏枸杞強，并且當(dāng)兩者以1∶1的配比制成復(fù)合多糖后，其超氧陰離子自由基能力清除能力增強，多糖復(fù)合后具有協(xié)同作用。

3 討 論

黃芪和枸杞都是傳統(tǒng)的大宗中藥，恒山黃芪生長于北岳恒山山脈海拔1 500～2 000 m向陽的山坡地帶[17]，常年最高氣溫不超過28 ℃，最低氣溫不低于-35 ℃，日照時間2 800～3 000 h，這種特殊的生長環(huán)境造就了恒山黃芪條直、粉大、皮白、芯黃的特點以及獨特的藥理作用。與其他產(chǎn)地的黃芪相比，恒山黃芪以粉性為主，植物纖維含量相對較低，總皂苷含量高于0.16%，遠高于2015版藥典規(guī)定的0.04%[1]。何盼等[19]分析了恒山黃芪和川黃芪的化學(xué)成分差異性，發(fā)現(xiàn)二者差異明顯，其中，恒山黃芪中的天冬氨酸、γ-氨基丁酸、檸檬酸、黃芪甲苷以及毛蕊異黃酮葡糖苷含量較高, 川黃芪中黃芪甲苷含量極低。寧夏枸杞又名甘枸杞，主要生長于中國川北、甘肅、寧夏、青海、新疆等地，具有明顯的旱生植物和鹽生植物的形態(tài)特征，其根、葉、果、皮皆可入藥，其中寧夏枸杞果實的主要成分包括枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素及類胡蘿卜素酯、維生素C、莨菪亭，以及多種氨基酸及微量元素等。李兆君等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，就總黃酮含量而言，寧夏枸杞(1.665%)低于黑果枸杞(2.710%)，但二者清除DPPH自由基的能力相當(dāng)。張波等[24]對寧夏、青海和新疆等3個產(chǎn)區(qū)的寧夏枸杞品質(zhì)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜素含量以寧夏產(chǎn)區(qū)最高，而多糖、甜菜堿以及浸出物的含量根據(jù)不同的寧夏枸杞品種有所不同，其中多糖含量以新疆和青海產(chǎn)區(qū)的寧夏枸杞較高。在本研究中，恒山黃芪的總抗氧化能力(T-AOC為0.67 U/mg)與超氧陰離子自由基清除能力(EC50為2.34 mg/mL)優(yōu)于寧夏枸杞多糖(T-AOC為0.52 U/mg，EC50為4.28 mg/mL)，而羥自由基清除能力(EC50為1.34 mg/mL)稍弱于寧夏枸杞多糖(EC50為0.98 mg/mL)，而且2種多糖的抗氧化能力均隨其濃度的增大而增強，顯示出了明顯的量效關(guān)系。

圖3 不同濃度多糖對超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig.3 Scavenging activities of the polysaccharides on superoxide anion radical

多糖PolysaccharideEC50/(mg/mL)枸杞多糖L.barbarumpolysaccharides4.28黃芪多糖Astragaluspolysaccharides2.34枸杞多糖∶黃芪多糖(1∶1)L.barbarum/HengshanAstragalus(1∶1)1.372,6-二叔丁基對甲酚BHT2.21水溶性維生素ETrolox1.25

多糖的結(jié)構(gòu)在一定程度上決定了其生物活性，例如趙雪等[25]的研究表明海帶多糖的抗氧化活性與其分子量、硫酸根含量、糖醛酸含量、巖藻糖含量以及中性多糖的組成密切相關(guān)，而糖鏈上的糖醛酸部分則最先被氧自由基氧化降解。目前對多糖抗氧化作用的研究多集中于單組分多糖，而對2種或2種以上多糖配伍而成的復(fù)合多糖抗氧化作用的研究不多。將不同種類多糖在一定濃度和比例下進行復(fù)合，多糖的高分子糖鏈在混合過程中發(fā)生構(gòu)象變化，在此過程中可能促進碳氫鏈上氫原子與氧自由基結(jié)合，從而增強多糖混合制劑抗氧化活性。例如王宏勛等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)枸杞和靈芝多糖按照4∶1的比例混合，濃度為 0.2 mg/mL時 , 對羥自由基的清除率較單一多糖提高13%，說明二者的復(fù)合多糖在清除羥自由基過程中產(chǎn)生了協(xié)同作用。在本研究中，將恒山黃芪多糖和寧夏枸杞多糖按照1∶1比例復(fù)合配伍后，總抗氧化能力為T-AOC=0.79 U/mg，清除羥自由基EC50值為0.84 mg/mL，清除超氧陰離子自由基EC50值為1.37 mg/mL，均優(yōu)于單一組份多糖，表明2種多糖經(jīng)過復(fù)合配伍后，產(chǎn)生了一定的協(xié)同效應(yīng)，并且表現(xiàn)出正協(xié)同量效關(guān)系。

綜上所述，恒山黃芪作為傳統(tǒng)中藥材黃芪中的珍品，其多糖成分具有良好的抗氧化活性，尤其是與寧夏枸杞多糖復(fù)合配伍后，抗氧化活性更強，表明恒山黃芪具有開發(fā)為新型抗氧化劑和抗衰老食品藥品的潛在價值。

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(編輯:潘新社)

Polysaccharides Extraction and Comparative Analysis on Antioxidative Activitiesinvitroof HengshanAstragalusandLyciumbarbarum

HU Jianran, LI Ping*, QIN Lupeng, WAN Tiantian, LIU Zhifang, FANG Yujie

(Department of Biological Sciences and Technology, Changzhi University, Changzhi, Shanxi 046011, China)

Polysaccharides were extracted from HengshanAstragalusandLyciumbarbarumby ultrasonic method, and then antioxidative activities of HengshanAstragaluspolysaccharides,L.barbarumpolysaccharides and the compound polysaccharides of them were accessed in this study. The results showed that: (1)The total antioxidant capacity [T-AOC =(0.67±0.12) U/mg] and superoxide anion radical scavenging capacity (EC50= 2.34 mg/mL) of HengshanAstragaluspolysaccharides were both higher than those ofL.barbarumpolysaccharides [T-AOC =(0.52±0.07) U/mg, EC50= 4.28 mg/mL], while hydroxyl radical scavenging capacity (EC50= 1.36 mg/mL) was lower than that ofL.barbarumpolysaccharides (EC50= 0.98 mg/mL). (2) T-AOC, hydroxyl radical scavenging capacity and superoxide anion radical scavenging capacity of the compound polysaccharides were significantly higher than those of any single polysaccharide. (3) Both any single polysaccharide and compound polysaccharides exhibited a dose-dependent effect. In conclusion, HengshanAstragaluspolysaccharides show remarkably high antioxidative activities, and are natural antioxidants with development potential. Besides, the compound polysaccharides of polysaccharides from HengshanAstragalusandL.barbarum(1∶1) enhance the antioxidative effects. Thus, this study may offer reference for further exploration of HengshanAstragaluspolysaccharides and natural antioxidants.

HengshanAstragalus;Lyciumbarbarum; compound polysaccharides; antioxidative activities; hydroxyl radical; superoxide anion radical

1000-4025(2016)08-1648-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1648

2016-04-28;修改稿收到日期:2016-07-27

山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(2015430)；長治學(xué)院博士啟動基金(200115)

胡建燃(1984-)，男，博士，講師，主要從事細胞生物學(xué)與天然產(chǎn)物藥理分析研究。E-mail：hjr_possible@163.com

*通信作者:李 平，博士，講師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)及天然產(chǎn)物藥理活性分析研究。E-mail：hitliping@163.com

Q946.8

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