韓 超，徐曉立

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 測(cè)試中心，廣州 510642)

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3種桉樹組培苗不定根發(fā)生發(fā)育過(guò)程的解剖學(xué)觀察

韓 超1，徐曉立2

(1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 測(cè)試中心，廣州 510642)

以巨尾桉‘GL9’、尾巨桉‘DH32-29’和尾邊桉‘XF35’3種桉樹無(wú)性系組培生根苗為材料，采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，對(duì)石蠟切片制作過(guò)程中的固定環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，觀察了桉樹不定根的發(fā)育過(guò)程。結(jié)果表明：(1)采用FAA固定液固定材料，可獲得染色清晰，組織完整的桉樹根系切片。(2)‘GL9’和‘DH32-29’在生根誘導(dǎo)8 d后生出不定根，生根類型為皮部生根；‘XF35’在生根誘導(dǎo)12 d后生出不定根，生根類型為愈傷組織生根；‘GL9’不定根的根尖和根基處均有細(xì)胞旺盛分裂，‘DH32-29’不定根只在根尖有細(xì)胞旺盛分裂，‘XF35’不定根則只在其根基處有大量旺盛分裂的細(xì)胞。

桉樹；根系；石蠟切片；不定根發(fā)育

采用石蠟切片法觀察植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程是一種較為傳統(tǒng)和成熟的技術(shù)[1]，應(yīng)用也較為廣泛，且已在很多種植物上有成功應(yīng)用的報(bào)道[2-3]。然而因不同植物在組織結(jié)構(gòu)和組成成分上的差異性，且石蠟切片操作步驟多，對(duì)最終制片效果的影響因素多，因此，加大了獲得較為理想的石蠟切片的難度，不易取得理想的觀察效果。因此，在許多研究領(lǐng)域，都需要對(duì)石蠟切片技術(shù)進(jìn)行改良[4-6]。

桉樹是桃金娘科(Mytraceae)杯果木屬(Angophora)、傘房屬(Corymbia)和桉屬(Eucalyptus)樹種的統(tǒng)稱[7]，是一種外來(lái)樹種?，F(xiàn)在對(duì)其研究主要集中在雜交育種、優(yōu)良無(wú)性系選育、分子育種及生態(tài)效應(yīng)等方面[8-11]，對(duì)其不定根誘導(dǎo)特性及機(jī)理的研究報(bào)道較少。本研究以尾葉桉×巨桉無(wú)性系‘DH32-29’(Eucalyptusurophylla×E.grandis)、巨桉×尾葉桉無(wú)性系‘GL9’(E.grandis×E.urophylla)和尾葉桉×邊沁桉無(wú)性系‘XF35’(E.urophylla×E.benthamii)為對(duì)象，改良了石蠟切片制片過(guò)程，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的根進(jìn)行發(fā)育解剖學(xué)研究，揭示了桉樹組培苗不定根的形成及發(fā)育進(jìn)程和特性。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑、儀器

切片材料為尾巨桉‘DH32-29’、巨尾桉‘GL9’和尾邊桉‘XF35’組培生根苗的根尖，實(shí)驗(yàn)材料于2015年8月份在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所組培室內(nèi)經(jīng)過(guò)增殖和生根誘導(dǎo)獲得，其中‘DH32-29’和‘GL9’為易生根組培苗，‘XF35’為難生根組培苗。熔點(diǎn)為56 ～ 58℃的切片石蠟(上海標(biāo)本模型廠)，TO透明劑(TO型生物制片透明劑，廣西岑溪縣松香廠產(chǎn)品)，KD-202A輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備廠)，Leica DM4000B 正置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方 法

1.2.1 取材與固定 桉樹組培苗開始生根培養(yǎng)后，分別在生根后2、5、8、10和12 d選取粗細(xì)長(zhǎng)短一致的不定根根尖(長(zhǎng)約1 cm)，每次取6份材料，3份置于FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶38%甲醛=18∶1∶1)，另外3份置于卡諾氏固定液(100%乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定24 h，目的是篩選出針對(duì)桉樹制片效果較好的固定液。固定后，洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水、染色、透明和封片等步驟參考常規(guī)切片方法[3]。

1.2.2 洗 滌 將固定后的材料依次移入50%乙醇、70%乙醇(2次)，分別洗滌15 min，再將材料移入70%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脫 水 將洗滌后的材料依次移入85%乙醇、95%乙醇，分別脫水1 h，再將材料移入無(wú)水乙醇(2次)分別脫水40 min。

1.2.4 透 明 將脫水后的材料依次移入TO透明劑和無(wú)水乙醇的等體積混合液、TO透明劑(2次)分別處理1 h。

1.2.5 浸蠟包埋與切片 加入碎的純石蠟后，將裝有材料的純TO透明劑瓶置于恒溫烘箱中42 ℃過(guò)夜，然后將烘箱升溫至60 ℃，并間隔不同時(shí)間(2和6 h)換純蠟2次。換純蠟后按照石蠟切片制作方法進(jìn)行包埋和切片，切片厚度為8 μm。

1.2.6 脫蠟與染色 用TO透明劑對(duì)切片進(jìn)行脫蠟，石蠟完全脫去后用番紅-固綠染色，中性樹膠封片。

1.2.7 不定根發(fā)育過(guò)程觀察 用Leica DM4000B 正置熒光顯微鏡分別觀察3種不同材料的生根發(fā)育過(guò)程，選取較清晰的視野拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固定液對(duì)切片的影響

用卡諾氏固定液固定材料切片時(shí)材料從蠟中脫離，形成空洞的蠟帶，無(wú)法制得可以觀察的切片；用FAA固定液固定材料切片時(shí)材料與蠟帶結(jié)合緊密，無(wú)裂紋，染色后材料內(nèi)部組織較完整，細(xì)胞界限清晰。

2.2 ‘DH32-29’不定根發(fā)育過(guò)程解剖結(jié)構(gòu)觀察

‘DH32-29’組培苗生根誘導(dǎo)2 d后，其基部莖段內(nèi)維管組織和皮層交界處出現(xiàn)了若干團(tuán)與周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不同的薄壁細(xì)胞，這些薄壁細(xì)胞體積較小、細(xì)胞密度較大，細(xì)胞質(zhì)濃(染色后顏色較深，圖1，a)，細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)分化至誘導(dǎo)5 d形成根原基并開始有向外擴(kuò)張趨勢(shì)(圖1，b)，至誘導(dǎo)8 d根原基繼續(xù)向外生長(zhǎng)，外表皮破裂(圖1，c)，誘導(dǎo)10 d不定根已完全突破表皮，根尖細(xì)胞數(shù)大量增加(圖1，d)，根增大增粗，根形態(tài)初步形成，外觀可見。

2.3 ‘GL9’不定根發(fā)育過(guò)程解剖結(jié)構(gòu)觀察

‘GL9’生根誘導(dǎo)第2天時(shí)，莖的形成層形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯變化(圖2，a)，至誘導(dǎo)第5天時(shí)，維管細(xì)胞從形成層位置開始向韌皮部方向加寬成多列，形成了排列緊密的與周圍細(xì)胞有明顯區(qū)別的圈狀薄壁細(xì)胞團(tuán)(圖2，b)，至誘導(dǎo)第8天時(shí)既觀察到有不定根已經(jīng)充分伸展和長(zhǎng)出，又有根尖突破表皮形成肉眼可見的不定根突起(圖2，c)，至第10天觀察到生出的不定根內(nèi)已有呈橢圓形的側(cè)根中柱細(xì)胞團(tuán)(圖2，d)。

a.生根誘導(dǎo)2 d; b.生根誘導(dǎo)5 d; c.生根誘導(dǎo)8 d; d.生根誘導(dǎo)10 d圖1 ‘DH32-29’不定根發(fā)育過(guò)程切片觀察a. 2 days after rooting induction; b. 5 days after rooting induction; c. 8 days after rooting induction; d. 10 days after rooting inductionFig.1 Anatomical observation on adventitious rooting of ‘DH32-29’

2.4 ‘XF35’不定根發(fā)育過(guò)程解剖結(jié)構(gòu)觀察

‘XF35’組培苗生根誘導(dǎo)開始后2 ～ 8 d內(nèi)發(fā)現(xiàn)形成層與皮層之間的一層細(xì)胞相比周圍的細(xì)胞密度更大且呈現(xiàn)不斷密集的狀態(tài)，但是未發(fā)現(xiàn)有向外分化的趨勢(shì)(圖3，a～c)。至誘導(dǎo)第10天出現(xiàn)由大量薄壁細(xì)胞形成的愈傷組織，在愈傷組織形成后，其內(nèi)部的一些細(xì)胞脫分化不斷分裂分化，逐漸發(fā)育成若干團(tuán)細(xì)胞核明顯、細(xì)胞質(zhì)濃、大小均一的根原基(圖3，d)。誘導(dǎo)12 d后不定根已形成，在已形成的不定根中繼續(xù)出現(xiàn)根原基(圖3，e ～ f)。

2.5 不同無(wú)性系桉樹生根發(fā)育過(guò)程比較

切片觀察發(fā)現(xiàn)，‘DH32-29’和‘GL9’都是皮部生根的類型，‘XF35’是愈傷組織生根的類型。組培苗外部形態(tài)觀察可知，‘DH32-29’和‘GL9’生根速度明顯快于‘XF35’，切片的觀測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證了這點(diǎn)，‘XF35’在第8天時(shí)尚未形成明顯的細(xì)胞層面的突起和變異。

3種材料的解剖結(jié)構(gòu)在接種后的最初幾天內(nèi)較相似，都是以維管形成層和皮層之間細(xì)胞的分裂活動(dòng)為主，但是‘DH32-29’和‘GL9’形成了相對(duì)明顯的根的原始形態(tài)，‘XF35’則未有明顯的根原始體發(fā)現(xiàn)。對(duì)比生根時(shí)間，‘DH32-29’和‘GL9’在生根苗接種8 d后已經(jīng)形成了較為完整的根結(jié)構(gòu)，‘XF35’生根苗接種12 d后形成根結(jié)構(gòu)。對(duì)照切片觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)根內(nèi)細(xì)胞分裂越旺盛，生根所需時(shí)間越短。對(duì)比根的分裂情況，‘DH32-29’根內(nèi)細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域集中在根尖；‘GL9’根內(nèi)的細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域既出現(xiàn)在根尖，又出現(xiàn)在根基；‘XF35’根內(nèi)細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域主要分布在根基。‘XF35’是在愈傷組織的中層部位首先產(chǎn)生點(diǎn)狀的分裂群，然后，這些分裂群的一部分向外延展，形成不定根。和‘GL9’一樣，它也是在不定根著生的基部分裂旺盛，從而推動(dòng)根不斷地向外伸長(zhǎng)。

a.生根誘導(dǎo)2 d; b.生根誘導(dǎo)5 d; c.生根誘導(dǎo)8 d; d.生根誘導(dǎo)10 d; e.生根誘導(dǎo)12 d，箭頭所指為維管組織; f.生根誘導(dǎo)12 d(局部)圖3 ‘XF35’不定根發(fā)育過(guò)程解剖觀察a. 2 days after rooting induction; b. 5 days after rooting induction; c. 8 days after rooting induction; d. 10 days after rooting induction; e. 12 days after rooting induction and vascular tissue was pointed out with arrow; f. 12 days after rooting induction (local enlarged)Fig.3 Anatomical observation on adventitious rooting of ‘XF35’

3 討 論

石蠟切片技術(shù)作為組織學(xué)觀察的常用技術(shù)，在桉樹根系形態(tài)和發(fā)育研究中的報(bào)道卻很少。本研究選取不同生根難度的桉樹組培苗，比較并優(yōu)化了石蠟切片制作過(guò)程中的固定操作(因?yàn)閮?yōu)化固定操作后，采用常規(guī)的切片制作方法，即取得了理想的切片觀察效果)，利用優(yōu)化后的石蠟切片法獲得了結(jié)構(gòu)清晰的桉樹組織切片。

通過(guò)對(duì)比本研究，并結(jié)合柃木[12]、楊樹[13]、四倍體刺槐[14]的生根解剖觀察，無(wú)論是皮部生根還是愈傷生根，生根發(fā)育過(guò)程都是先在形成層形成一小團(tuán)與周圍細(xì)胞在外觀上有明顯差異的薄壁細(xì)胞群，這群細(xì)胞體積明顯比周圍細(xì)胞小(因?yàn)檫@團(tuán)細(xì)胞核被染色的比例明顯高于周圍細(xì)胞，因此，可以推測(cè)出這團(tuán)細(xì)胞正在進(jìn)行旺盛分裂)，排列緊湊、細(xì)胞核在細(xì)胞中占比例較大。該群細(xì)胞切向分裂速度明顯大于橫向和徑向分裂速度，形成一個(gè)穿過(guò)韌皮部及維管束鞘、突入皮層的乳頭狀不定根原基。隨著根原基的不斷生長(zhǎng)，皮層細(xì)胞被擠壓，破裂，形成缺口，此時(shí)，根原基內(nèi)細(xì)胞則在一定部位進(jìn)行旺盛分裂，推動(dòng)根原基不斷向外伸長(zhǎng)，形成外露的不定根。

不定根按其形成部位可分為皮部生根型(也稱直接發(fā)生)、愈傷組織生根型(也稱間接發(fā)生)和混合生根型[15]。本研究通過(guò)觀察3種桉樹組培苗生根發(fā)育過(guò)程，發(fā)現(xiàn)‘DH32-29’和‘GL9’組培苗不定根生根類型為皮部生根，‘XF35’組培苗不定根生根類型為愈傷組織生根。除桉樹外，Koyuncu等[16]研究證實(shí)茶樹插穗的不定根原基起始于維管形成層和次生韌皮薄壁細(xì)胞，為皮部生根；王清民等[17]研究核桃試管嫰莖的誘導(dǎo)生根過(guò)程發(fā)現(xiàn)，核桃嫩莖不定根原基起源于形成層細(xì)胞，也為皮部生根。而孫婷婷等[18]則發(fā)現(xiàn)黃刺玫扦插生根是由愈傷組織木質(zhì)部外側(cè)具有根原始體特征的細(xì)胞不斷分化而來(lái)的，為愈傷生根；扈順[15]研究中發(fā)現(xiàn)四合木莖插穗不定根由誘生根原基發(fā)育而來(lái)，誘生根原基則是由愈傷組織的薄壁細(xì)胞反分化形成，也為愈傷生根。張梅春等[19]研究紫衫扦插插穗生根過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫衫插穗有兩種生根類型，其嫩枝插條為愈傷組織生根，由愈傷組織中大量的維管組織結(jié)節(jié)分化形成；其木質(zhì)化插穗是皮部生根和愈傷組織生根并存，先是皮部生根且大部分是皮部生根。由此可見，木本植物的生根類型主要包含愈傷生根和皮部生根2種，也有混合生根型的存在。皮部生根的樹種，由于本來(lái)就有根原基，扦插后可以很快長(zhǎng)出根系，比較容易成活。但是，那些根原基較少的樹種如毛白楊，扦插后由根原基長(zhǎng)出的不定根數(shù)量少，比較不易成活。所以像毛白楊類的樹種，雖然也是皮部生根類型，但不容易扦插成活，需要采取嫁接、ABT生根粉或生長(zhǎng)素、腐殖酸鈉等藥劑的處理等方法來(lái)誘導(dǎo)生根。愈傷組織生根的樹種，首先形成由薄壁細(xì)胞組成的愈傷組織，然后，不定根原始體在其內(nèi)部或表皮部位形成，不斷生長(zhǎng)發(fā)育后形成不定根。通常情況下，皮部生根因無(wú)需誘導(dǎo)愈傷，因此生根會(huì)比較快，愈傷生根則經(jīng)常需要更多的時(shí)間。從桉樹來(lái)看，‘DH32-29’和‘GL9’是皮部生根，且較易生根，推測(cè)是其形成層已存在可生根的根原基；‘XF35’是愈傷生根，推測(cè)‘XF35’可能缺少根原基，才需要誘導(dǎo)愈傷生根。

有研究發(fā)現(xiàn)，莖段皮層的構(gòu)造對(duì)不定根的發(fā)生有一定影響[20]，如果皮層中存在環(huán)狀厚壁組織時(shí)，生根則較難，反之，生根則相對(duì)容易。如棗樹枝條靠近真皮部的皮層薄壁組織間有一帶狀厚壁組織，對(duì)扦插后根原基形成和生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了障礙作用[21]；銀樺插穗莖的韌皮部外方具有5層韌皮纖維細(xì)胞，不呈環(huán)狀連續(xù)排列[22]，這些厚壁組織導(dǎo)致其生根困難。本研究通過(guò)切片觀察發(fā)現(xiàn)，3個(gè)桉樹無(wú)性系的莖段均無(wú)厚壁組織，說(shuō)明3個(gè)無(wú)性系均無(wú)阻礙其生根的細(xì)胞結(jié)構(gòu)?！瓺H32-29’和‘GL9’在生根苗接種8 d后形成了較為完整的根結(jié)構(gòu)，‘XF35’在生根誘導(dǎo)12 d后生根，推測(cè)原因是‘XF35’直到接種第10天才形成愈傷組織。另外，雖然‘XF35’生根速度較慢，但是，若從其愈傷上開始生根的時(shí)間節(jié)點(diǎn)開始計(jì)算，其生根則只需要2 ～ 4 d，4 d后可形成長(zhǎng)度超過(guò)2 mm的不定根，生成愈傷后的生根速度是‘DH32-29’和‘GL9’的2倍。查閱其他植物誘導(dǎo)不定根的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，楊樹組培苗生根誘導(dǎo)8 d，可以直接觀察到不定根發(fā)生；誘導(dǎo)10 d后，外觀能看到粗而長(zhǎng)的根[13]，由此可見，組培誘導(dǎo)時(shí)，這2種植物生根速度趨于一致。此外，馬尾松[23]、歐李[24]、四倍體刺槐[14]等木本植物嫩枝扦插誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生所需時(shí)間比桉樹長(zhǎng)，而桉樹與楊樹[25]、牡丹[26]等植物的不定根發(fā)生所需時(shí)間相似。因此，桉樹屬于不定根誘導(dǎo)產(chǎn)生速率較快的樹種。

從已形成根的解剖結(jié)構(gòu)看，不同桉樹之間根的生長(zhǎng)狀態(tài)的差異體現(xiàn)在分裂旺盛區(qū)域的不同，‘DH32-29’根內(nèi)的細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域既出現(xiàn)在根尖，又出現(xiàn)在根基；‘GL9’根內(nèi)細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域集中在根尖；‘XF35’根內(nèi)細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域主要分布在根基。對(duì)比其他植物的根發(fā)育情況，王寧等[27]研究發(fā)現(xiàn)草莓側(cè)根細(xì)胞分裂旺盛的區(qū)域集中在根尖，王云麗[28]的觀察發(fā)現(xiàn)沙棘扦插后不定根細(xì)胞分裂旺盛區(qū)域集中在根尖，謝志南等[29]觀測(cè)到三角梅的扦插生根過(guò)程中根尖細(xì)胞分裂較旺盛，而分裂旺盛區(qū)域出現(xiàn)在根基的植物則未見報(bào)道。

本研究對(duì)3種桉樹組培苗的不定根發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了石蠟切片觀察，為發(fā)現(xiàn)桉樹組培苗不定根的形成和發(fā)育過(guò)程提供了解剖學(xué)依據(jù)。另外，如果能夠結(jié)合生根誘導(dǎo)過(guò)程的激素調(diào)控和分子層面的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)研究，則可將桉樹不定根的發(fā)育機(jī)理研究推向深入。而更多有價(jià)值的生根機(jī)理的發(fā)現(xiàn)，可為提高桉樹不定根，特別是難生根桉樹不定根的誘導(dǎo)率提供理論支持。

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(編輯:潘新社)

Research of Anatomy Observation on Adventitious Rooting Genesis and Development of Three Rooting Culture Seedlings ofEucalyptus

HAN Chao1*, XU Xiaoli2

(1 Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China； 2 Instrumental Analysis & Research Center, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

This paper optimized the fixing procedure of the routine paraffin section technology and observed the process of adventitious rooting development of three culture rooting seedlings ofEucalyptusclones ‘DH32-29’, ‘GL9’ and ‘XF35’. The results showed that: (1) FAA fixing solution was better with clear staining and tissue integrity root slice onEucalyptus. (2) Adventitious roots of ‘DH32-29’ and ‘GL9’ originated after 8 days being induced and belongs to cortices rooting type. Adventitious roots of ‘XF35’ originated after 12 days being inducted and belongs to callus rooting type. Active-division cells are in root tip and root foundation of ‘GL9’ adventitious root. Active-division cells are only in root tip of ‘DH32-29’ adventitious root. Active-division cells are only in root foundation of ‘XF35’ adventitious root.

Eucalyptus; root; paraffin section; adventitious roots development

1000-4025(2016)08-1594-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1594

2016-05-03;修改稿收到日期:2016-07-22

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(CAFYBB2014QA011)

韓 超(1980-)，男，博士，助理研究員，主要從事倍性育種、植物表觀遺傳和功能植物生理調(diào)控研究。E-mail :hc2356@163.com

Q944.54; S791. 248. 05

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