劉繼愷，高永峰，吳嬋娟，張 林，陳彩霞

(1 西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010；2 西南科技大學(xué) 核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽(yáng) 621010)

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煙草氧化脅迫相關(guān)基因NtOSA1的克隆表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析

劉繼愷1, 2，高永峰1，吳嬋娟1, 2，張 林1，陳彩霞1

(1 西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010；2 西南科技大學(xué) 核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川綿陽(yáng) 621010)

植物類蛋白激酶Abc1家族(activity of bc1 complex)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫中起著重要的作用。該研究通過(guò)將擬南芥AtOSA1蛋白氨基酸序列與煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，利用巢式PCR技術(shù)克隆得到1個(gè)煙草氧化脅迫相關(guān)Abc1家族基因NtOSA1，NtOSA1與擬南芥AtOSA1基因具有72.89%的一致性。NtOSA1基因開放閱讀框長(zhǎng)度為2 283 bp，編碼760個(gè)氨基酸，含有典型的ABC1結(jié)構(gòu)域、一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域、葉綠體定位信號(hào)肽和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)NtOSA1基因在煙草不同組織以及氧化脅迫、鹽脅迫等處理下的表達(dá)分析表明：NtOSA1基因的表達(dá)具有組織特異性，主要在葉片中表達(dá)；NtOSA1基因在H2O2和NaCl處理后表達(dá)量上升，均在處理后6 h達(dá)到最大值，分別為處理前的1.95和2.69倍。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，NtOSA1蛋白定位在細(xì)胞葉綠體上，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。研究表明，NtOSA1基因參與了煙草抗氧化脅迫和鹽脅迫的響應(yīng)。

煙草；氧化脅迫相關(guān)Abc1基因；基因克??；表達(dá)特性；亞細(xì)胞定位

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可避免會(huì)遭遇到各種逆境脅迫，如高溫、低溫、干旱、重金屬和鹽堿等。這些逆境脅迫會(huì)使植物氧化還原代謝失衡，導(dǎo)致體內(nèi)積累大量的活性氧，從而產(chǎn)生氧化脅迫。過(guò)量的活性氧能與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而造成機(jī)體損傷甚至死亡[1]。

生物體內(nèi)存在多種參與氧化脅迫響應(yīng)的蛋白家族，比如Abc1家族，該家族是一類龐大的具有多種生物學(xué)功能的蛋白家族，廣泛存在于原核和真核生物中，這類蛋白具有高度保守的ABC1結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域[2]。在原核和真核生物線粒體中，Abc1-like蛋白是輔酶Q合成的重要調(diào)控因子，參與到呼吸鏈的電子傳遞和抗氧化過(guò)程[3-8]。酵母COQ8是第一個(gè)被鑒定的Abc1基因，其編碼蛋白具有類分子伴侶活性，能夠抑制細(xì)胞色素b mRNA翻譯的缺陷以及維持線粒體呼吸鏈中bc1復(fù)合體的活性[9-10]。

和酵母相比，植物的Abc1-like蛋白具有更多樣的功能[11-13]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中有17個(gè)基因含有典型的ABC1結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)被研究的是ABC1At基因，該基因在擬南芥各個(gè)組織中組成型表達(dá)，其編碼的線粒體蛋白與酵母ABC1蛋白有45%的相似性，且具有酵母ABC1蛋白相似的功能[14]。另外一個(gè)Abc1蛋白，AtOSA1(oxidative stress-related Abc1-like protein)雖然也和酵母ABC1具有45%的相似性，但是該蛋白定位于細(xì)胞葉綠體中，功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，AtOSA1蛋白不能恢復(fù)酵母abc1突變體呼吸鏈的活性。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，AtOSA1基因的表達(dá)受到CdCl2、H2O2和高強(qiáng)度光的誘導(dǎo)[11]。Yang等的研究顯示，AtACDO1蛋白(ABC1-like kinase related to chlorophyll degradation and oxidative stress)定位于葉綠體中，在光氧化脅迫耐受和葉綠素降解過(guò)程中發(fā)揮作用[13]。擬南芥ABC1K1和ABC1K3蛋白也定位于葉綠體質(zhì)體球，調(diào)控質(zhì)體球異戊二烯基-脂代謝過(guò)程，在植物逆境應(yīng)答和葉綠體形態(tài)建成中發(fā)揮著重要作用[15-16]。AtSIA1(salt-induced ABC1 kinase 1)與AtOSA1具有46%的相似性，同樣定位于細(xì)胞葉綠體中，表型分析證明，AtSIA1和AtOSA1能夠影響葉綠體中Fe的分布，調(diào)控對(duì)活性氧的產(chǎn)生和氧化脅迫的應(yīng)答[17]。此外，王彩香等[18]克隆了一個(gè)小麥(Triticumaestivum)類ABC1基因TaABC1L，并發(fā)現(xiàn)該基因能夠被滲透、高鹽、低溫脅迫以及ABA處理誘導(dǎo)。高清松等[19]研究發(fā)現(xiàn)，水稻(Oryzasativa)ABC1基因主要在葉片中表達(dá)，并且受多種非生物脅迫因素包括H2O2、ABA、低溫以及高鹽等的調(diào)控。

煙草(Nicotianatabacum)是分子生物學(xué)和基因工程研究的模式植物，是最有價(jià)值的科研生物材料之一。煙草抗逆脅迫應(yīng)答過(guò)程中相關(guān)基因的克隆及功能的揭示一直是研究的熱點(diǎn)，但目前關(guān)于煙草Abc1蛋白家族的功能研究還未見報(bào)道。本研究首次從煙草中克隆到了OSA1的同源基因NtOSA1，對(duì)其序列特征、組織表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位及各種非生物脅迫響應(yīng)進(jìn)行了研究，為全面解析NtOSA1基因在煙草氧化脅迫和鹽脅迫應(yīng)答中的生物學(xué)功能提供了重要參考。

1 材料和方法

1.1 煙草材料

供試植物材料為煙草‘NC89’，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)種植。

1.2 方 法

1.2.1 煙草NtOSA1基因克隆 用擬南芥AtOSA1蛋白的氨基酸序列在SGN網(wǎng)站(http://solgenomics.wur.nl/)進(jìn)行序列比對(duì)(數(shù)據(jù)庫(kù)為煙草SGN mRNA序列，程序?yàn)榈鞍仔蛄袑?duì)核苷酸序列)。根據(jù)比對(duì)出的兩條EST序列，SGN-E1015449和SGN-E1113121，設(shè)計(jì)外側(cè)引物NtOSA1-F1(5′-TTCCCTTGCATGCACATACA-3′)和NtOSA1-R1(5′-TGATCTCCCAGGGTAACCAT-3′)；含有SmaI和SalI酶切位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)引物NtOSA1-F2(5′-CCCGGGATGGCGAGTATTTCAGCTAC-3′)和NtOSA1-R2(5′-GTCGACAGCTGTTCCTGTGATCA -3′)。提取煙草幼苗葉片總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，NtOSA1-F1和NtOSA1-R1為引物，用高保真酶PrimeSTAR HS(TaKaRa公司)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍，以稀釋后的DNA為模板，NtOSA1-F2和NtOSA1-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pEASY-Blunt載體(北京全式金生物公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherchiacoli)DH5α。以大腸桿菌單克隆為模板，NtOSA1-F2和NtOSA1-R2為引物，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 煙草NtOSA1基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN v6軟件分析測(cè)序結(jié)果，確定NtOSA1基因的開放閱讀框(ORF)序列并推導(dǎo)相應(yīng)的氨基酸序列。利用在線軟件InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分別預(yù)測(cè)NtOSA1蛋白的功能保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件ProtParam分析NtOSA1的氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用在線軟件TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)NtOSA1蛋白的亞細(xì)胞定位。通過(guò)ClustalW和MEGA6.0軟件相結(jié)合對(duì)32個(gè)Abc1蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用Bootstrap test檢驗(yàn)(重復(fù)值為1 000)進(jìn)化樹的可靠性。

1.2.3 煙草NtOSA1基因在不同部位表達(dá)量定量檢測(cè) 將野生型煙草種子播種到土里，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，濕度60%～70%，16 h光照/8 h黑暗。

設(shè)計(jì)NtOSA1基因qRT-PCR引物NtOSA1 rt-F(5′-TGTTCTGGTGCCTACTGGTGAC -3′)和NtOSA1rt-R(5′-AAGTTCTGCTTGTGCCATTTC-3′)，以煙草NtRL2(GenBank登錄號(hào)Z14081)為內(nèi)參基因，引物為 NtRL2 rt-F(5′-GTAAGGGAGCGGGTTCAGTCT-3′)和NtRL2 rt-R(5′-AACGGA GCACCCCTACCTG -3′)。按照Trizol(Thermo公司)試劑盒說(shuō)明書操作，分別提取野生型煙草根、莖、葉片、花和種子的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。按RealMasterMix(天根生化科技有限公司)試劑盒說(shuō)明書，在CFX96Real-Time System(Bio-Rad公司)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，65 ℃延伸5 s，然后以每秒0.5 ℃升至95 ℃，61個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 煙草的脅迫處理及NtOSA1基因的表達(dá)量檢測(cè) 參照Lee[20]等的方法，將煙草播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基[21]上，生長(zhǎng)2周，選取長(zhǎng)勢(shì)良好，大小一致的幼苗分別轉(zhuǎn)入含10 mmol/L H2O2和200 mmol/L NaCl的1/2 MS液體培養(yǎng)基中，在處理的0、3、6和12 h取幼苗樣品，液氮速凍后置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

參照Hermand等[22]的方法，將煙草播種于定植泡沫中，用1/2 Hoagland[23]營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)煙草，生長(zhǎng)30 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)良好，大小一致的幼苗連同定植泡沫轉(zhuǎn)入分別含0、30、60和100 μmol/L CdCl2的新鮮1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，在處理的48 h取幼苗葉片，液氮速凍后置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

提取以上處理材料的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，以NtOSA1rt-F和NtOSA1rt-R，NtRL2 rt-F和NtRL2 rt-R為引物，按照RealMasterMix(天根生化科技有限公司)試劑盒說(shuō)明書，在CFX96Real-Time System(Bio-Rad公司)進(jìn)行qRT-PCR，分析NtOSA1基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，65 ℃延伸5 s，然后以每秒0.5 ℃升至95 ℃，61個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算，DPS v7.05進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 融合表達(dá)載體的構(gòu)建、煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及熒光顯微鏡觀察 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pTEX-GFP含有氨芐青霉素篩選標(biāo)記、CaMV35S啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和GFP基因編碼區(qū)序列。

用SmaI和SalI(Thermo公司)同時(shí)雙酶切測(cè)序正確的NtOSA1基因片段和pTEX-GFP載體，將完整的NtOSA1基因編碼區(qū)插入到pTEX-GFP載體的多克隆位點(diǎn)，使NtOSA1和GFP基因融合表達(dá)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。以大腸桿菌單克隆為模板，NtOSA1-F2和NtOSA1-R2為引物，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

以本生煙草(Nicotianabenthamiana)為實(shí)驗(yàn)材料，參照Yoo等[24]的方法制備煙草原生質(zhì)體，將酶解條件改為黑暗酶解4 h。將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體pTEX-NtOSA1-GFP通過(guò)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到本生煙草原生質(zhì)體中，室溫下(20～25)℃黑暗誘導(dǎo)24～48 h。利用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(卡爾蔡司公司，型號(hào)LSM710)，觀察NtOSA1-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況。設(shè)定參數(shù)：GFP蛋白的激發(fā)光為488 nm，吸收光為500～525 nm；葉綠體的激發(fā)光為633 nm，吸收光為650～720 nm。

粗體表示葉綠體定位信號(hào)肽；下劃線表示ABC1結(jié)構(gòu)域；粗斜體表示跨膜結(jié)構(gòu)域；*表示終止密碼子圖1 NtOSA1的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Chloroplast targeting pre-sequences are presented in bold; Underline represents the ABC1 conserved domain; Putative trans-membrane spans are presented in bold italic; *Stop codonFig. 1 cDNA and deduced amino acid sequences of NtOSA1

深灰色框代表ABC1結(jié)構(gòu)域；淺灰色框代表激酶結(jié)構(gòu)域；白色框代表跨膜結(jié)構(gòu)域圖2 煙草NtOSA1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖Dark gray box, ABC domain; Light gray box, kinase domain; White barrels, predicted transmembrane domainsFig. 2 Schematic representation of the NtOSA1 protein

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtOSA1基因克隆及序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的片段與擬南芥AtOSA1基因核苷酸序列具有高度的一致性(72.89%)，因此命名為NtOSA1(GenBank登錄號(hào)KU565475)。NtOSA1基因的開放閱讀框長(zhǎng)度為2 283 bp，編碼760個(gè)氨基酸。

為了解NtOSA1蛋白的生物學(xué)活性及潛在功能，利用在線軟件分別對(duì)NtOSA1蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：NtOSA1蛋白分子量為86.07 kD，理論等電點(diǎn)為8.92；在氨基酸序列的277～397具有ABC1結(jié)構(gòu)域，在364～502具有激酶結(jié)構(gòu)域，NtOSA1蛋白C端具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于氨基酸序列的703～721和726～743(圖1、2)。將擬南芥、水稻、酵母和集胞藻4個(gè)物種的典型Abc1蛋白與NtOSA1蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)NtOSA1具有典型的ABC1保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，表明NtOSA1屬于Abc1家族。

AtOSA1(At5g64940)和AtABC1(At4g01660)來(lái)自擬南芥；OsABC1(Os02g0575500)來(lái)自水稻；SynABC1(P73627)來(lái)自集胞藻；ScCOQ8(EWH18611.1)來(lái)自酵母圖3 煙草NtOSA1與其他物種ABC1結(jié)構(gòu)域比對(duì)AtOSA1(At5g64940)and AtABC1(At4g01660)are from Arabidopsis thaliana；OsABC1(Os02g0575500)is from Oryza sativa；SynABC1(P73627)is from Synechocystis；ScCOQ8(EWH18611.1)is from Saccharomyces cerevisiaeFig. 3 Comparison of ABC1 domain alignments among NtOSA1 and other species

節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值表示Bootstrap重復(fù)1 000次的置信度圖4 煙草NtOSA1與其它Abc1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Values at nodes show the confidence level of Bootstrap replication 1 000Fig. 4 Phylogenetic tree of the alignment of NtOSA1 deduced amino acid sequence with other Abc1 proteins

2.2 煙草NtOSA1基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

選取酵母、擬南芥、水稻、玉米、集胞藻等12個(gè)物種的32個(gè)Abc1蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)顯示，NtOSA1蛋白與擬南芥AtOSA1蛋白的親緣關(guān)系最近，一致性為76.04%；與玉米ADB13188蛋白的一致性為74.15%；與水稻Os02g0575500的一致性為73.45%。表明，NtOSA1與擬南芥、玉米和水稻的親緣關(guān)系相對(duì)較近，而與第一個(gè)被鑒定的Abc1蛋白、酵母ScCOQ8、以及擬南芥AtABC1和人類HsCABC1的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

2.3 煙草NtOSA1基因的組織表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)NtOSA1基因在煙草不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖5)，NtOSA1基因主要在煙草葉片中表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量是根中的137.83倍)，在花中有少量表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量是根中的10.75倍)，而在根、莖和種子中的表達(dá)量很低，幾乎檢測(cè)不到。表明，NtOSA1基因具有組織特異表達(dá)的特征。

2.4 不同脅迫條件下煙草NtOSA1基因的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)NtOSA1基因在10 mmol/L H2O2和200 mmol/L NaCl處理后不同時(shí)間點(diǎn)的煙草幼苗中的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示(圖6，Ⅰ)，NtOSA1基因在H2O2和NaCl處理前期表達(dá)量上升，均在處理后6 h達(dá)到最大值，分別為處理前的1.95和2.69倍。在H2O2處理后12 h，NtOSA1基因表達(dá)量受到部分抑制，為處理前的0.6倍，在NaCl處理后12 h，NtOSA1基因表達(dá)量恢復(fù)到

處理前水平。

用不同質(zhì)量濃度的CdCl2處理煙草水培苗，qRT-PCR結(jié)果顯示(圖6，Ⅱ)，NtOSA1基因的表達(dá)量在不同質(zhì)量濃度CdCl2處理下沒有顯著性差異，暗示該基因可能并不參與煙草植株體內(nèi)CdCl2的應(yīng)答。

2.5 煙草NtOSA1蛋白的亞細(xì)胞定位

TargetP 1.1 Server軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NtOSA1蛋白N端含有一個(gè)46個(gè)氨基酸的葉綠體定位信號(hào)肽(圖1)，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞葉綠體中，可靠性等級(jí)為1，為最高等級(jí)。用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)NtOSA1蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，NtOSA1定位于細(xì)胞葉綠體中(圖7)，與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果符合。

圖5 煙草NtOSA1基因在不同組織中的表達(dá)Fig. 5 Expression profiles of NtOSA1 gene in different tissues of tobacco

不同大寫字母表示同一處理不同時(shí)間點(diǎn)(濃度)的顯著性差異(P<0.01，LSD檢驗(yàn))圖6 煙草NtOSA1基因?qū)2O2,NaCl(Ⅰ)和CdCl2(Ⅱ)的響應(yīng)Different capital letters refer to significant differences among different time points(cencentration) of the same treatment (P<0.01, LSD test)Fig. 6 Expression analysis of NtOSA1 gene in response to H2O2, NaCl (Ⅰ) and CdCl2 (Ⅱ) treatment

a. 葉綠體自發(fā)熒光；b. NtOSA1-GFP蛋白熒光；c. 合并圖圖7 NtOSA1-GFP蛋白在煙草原生質(zhì)體中的熒光顯微觀察a. The fluorescence of chlorophyll; b. The fluorescence of NtOSA1-GFP; c. Merged imageFig. 7 Fluorescence microscope observation of NtOSA1-GFP proteins in tobacco mesophyll protoplasts

3 討 論

Abc1家族在進(jìn)化過(guò)程中演化成了兩種獨(dú)立的類型：一種存在于藍(lán)藻細(xì)菌和葉綠體，比如擬南芥AtOSA1蛋白，另一種存在于線粒體，比如酵母ScCOQ8[17]。本研究克隆得到的NtOSA1基因與擬南芥AtOSA1基因同源性極高，其編碼蛋白具有典型的ABC1保守結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，NtOSA1與來(lái)自于擬南芥、水稻和玉米等植物的Abc1蛋白親緣關(guān)系較近，而與酵母ScCOQ8親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，NtOSA1蛋白定位于煙草原生質(zhì)體細(xì)胞的葉綠體中，這與AtOSA1蛋白的定位結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，煙草NtOSA1是Abc1家族的同源基因，其編碼蛋白屬于Abc1家族的第一種類型，可能與AtOSA1蛋白具有相似的功能。

研究顯示，AtOSA1基因主要在擬南芥的葉片中表達(dá)，其次為花中，在莖中有少量表達(dá)，在根中的表達(dá)量非常低[11]。此外，水稻ABC1基因也主要在葉片中表達(dá)[19]。本研究中，組織表達(dá)分析表明，NtOSA1基因在煙草不同組織中的表達(dá)量具有明顯差異，主要在葉片中表達(dá)，其次為花、根、莖和種子，為組織特異性表達(dá)，這與擬南芥AtOSA1基因和水稻ABC1基因的表達(dá)模式相一致。由于花組織中含有綠色的萼片，并且NtOSA1蛋白定位于細(xì)胞的葉綠體中，這些結(jié)果暗示，NtOSA1基因主要在綠色組織中表達(dá)。隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展和日趨成熟，對(duì)于能夠驅(qū)動(dòng)外源片段在特異組織表達(dá)的啟動(dòng)子的需求越來(lái)越大。煙草NtOSA1基因的組織表達(dá)結(jié)果暗示，該基因的啟動(dòng)子是一種綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子，因此下一步對(duì)NtOSA1基因啟動(dòng)子的克隆及功能研究，將會(huì)為組織特異性啟動(dòng)子的開發(fā)和利用提供重要的遺傳資源和數(shù)據(jù)支撐。

之前的研究表明，擬南芥AtOSA1基因的表達(dá)量受到CdCl2的調(diào)控，而本研究發(fā)現(xiàn)，煙草NtOSA1基因的表達(dá)量在不同質(zhì)量濃度CdCl2處理下沒有顯著差異，表明OSA1基因在不同物種中基因表達(dá)調(diào)控方式存在差異。擬南芥AtOSA1基因的突變能夠?qū)е轮仓陮?duì)氧化脅迫的敏感度增加，本研究發(fā)現(xiàn)煙草NtOSA1基因在H2O2和NaCl處理后表達(dá)量上升，均在處理后6 h達(dá)到最大值，這一結(jié)果也與小麥和水稻ABC1基因的表達(dá)調(diào)控特性相一致。以上結(jié)果暗示，NtOSA1基因參與了煙草氧化脅迫和鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，這為今后闡明煙草NtOSA1基因的生物學(xué)功能，以及通過(guò)基因工程的方法提高煙草抗逆性提供了理論基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning， Expression Characterization and Subcellular Localization ofNtOSA1 Gene fromNicotianatabacum

LIU Jikai1, 2, GAO Yongfeng1, WU Chanjuan1, 2, ZHANG Lin1, CHEN Caixia1

(1 School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China; 2 Fundamental Science on Nuclear Wastes and Environmental Safety Laboratory, Southwest University of Science and Technology, Mianyang, Sichuan 621010,China)

Members of the activity of bc1 complex (Abc1) family are protein kinases that are functionally diverse proteins with multiple roles in the regulation of plant growth and development and abiotic stress tolerance. According to the amino acid sequence of AtOSA1 and the transcriptome data ofNicotianatabacum, a Abc1 like gene was isolated and designated asNtOSA1, as for the high identity with theAtOSA1 (Arabidopsisthalianaoxidative stress-related Abc1-like protein). The open reading frame (ORF) of theNtOSA1 gene is 2 283 bp which encoded a deduced protein including 760 amino acid residues. The protein sequence of NtOSA1 possesses a conserved ABC1 domain, one kinase domain, one chloroplast localization signal peptide and two transmembrane spans. The relative expression ofNtOSA1 was determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The results showed thatNtOSA1 gene was expressed particularly in leaves, but also in flowers. After treatment of H2O2and NaCl for 6 h, the expression ofNtOSA1 increased to the maximum, which was 1.95 and 2.69 folds of the control, respectively. When fused to green fluorescent protein (GFP), NtOSA1 localized to the chloroplast in tobacco protoplasts, which was consistent with the prediction results of the software TargetP 1.1 Server. These results suggested thatNtOSA1 may be involved in response to oxidative and salt stress in tobacco.

Nicotianatabacum；oxidative stress-related abc1-like protein；gene clone；expression characterization；subcellular localization

1000-4025(2016)08-1499-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.08.1499

2016-04-27;修改稿收到日期:2016-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31500205)；西南科技大學(xué)博士研究基金(14zx7153)；西南科技大學(xué)校長(zhǎng)機(jī)動(dòng)費(fèi)特殊資助(14zx1104)；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程中心項(xiàng)目(13zxsk02)

劉繼愷(1983-)，女，博士，講師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：kateryan@163.com

Q785;Q786

A