武威，焦陽，陳曉平*

（1.吉林省標準研究院，吉林長春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽工藝研究

武威1，焦陽2，陳曉平2*

（1.吉林省標準研究院，吉林長春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）

該研究利用Box-Behnken中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析法，以五味子果仁冰醋酸抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，對冰醋酸提取法提取五味子果仁中抗菌肽的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果表明，冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為：冰醋酸濃度10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min。在此工藝條件下，所提取的抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論值（2.10 cm）的相對誤差僅為1.09%，表明擬合方程與實際相符合，所得結(jié)果準確可靠。

響應(yīng)面法；冰醋酸提??；五味子果仁；抗菌肽

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）是長白山重要的具有明顯保健功能的特色植物資源之一［1-2］。木脂素類物質(zhì)、多糖類化合物和肽類是五味子主要的功效成分。五味子具有極高的藥用和食用價值，具有滋補、抗腫瘤、抗氧化等多種功效，因此，具有較高的研究和開發(fā)利用價值［3-5］。

抗菌肽是具有抗菌活性肽類的總稱。作為多種生物機體內(nèi)重要的防御物質(zhì)之一，抗菌肽具有廣譜性、熱穩(wěn)定性好、水溶性佳等眾多優(yōu)點，廣泛存在于植物、動物等機體內(nèi)［6-8］。植物抗菌肽的作用機制相對來說比較靈活，它可以破壞有害細菌的細胞壁或者溶解其細胞膜以及使其細胞的某些細胞器失去相應(yīng)的功能來殺死有害細胞［9-11］。常用抗菌肽分離純化的方法主要有：化學萃取法、超濾法、凍融法、酶解法、沉淀法、離心法、色譜分離法、層析法、電泳法等［12］。

本研究提取抗菌肽的方法主要是依照王雅麗等［13-14］采用的冰醋酸法及乙醇法提取鰻鱺、林蛙中抗菌肽的工藝方法。近年來對五味子活性成分的研究很多，但多集中于五味子的果肉部分，而對其果仁部分的研究鮮見報道［15-16］。本研究利用Box-Behnken中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析法，以五味子果仁冰醋酸提取物對大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，對冰醋酸浸提法的主要工藝參數(shù)進行優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

五味子：長白山藍景坊科技股份有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）：吉林農(nóng)業(yè)大學食品工程教研室保菌中心。

冰醋酸、乙醇（分析純）：北京化工廠；瓊脂粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氯化鈉（分析純）、氨芐青霉素（優(yōu)級純）：北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，以2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，121℃高壓滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂粉。121℃高壓滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

XA-10固體樣品粉碎機：金壇市科析儀器有限公司；SPA-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；HD-1360潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；FA1004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；LG10-2.4A高速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；FD-1C-50冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1材料預(yù)處理

將五味子浸泡去果肉，所得果仁用蒸餾水洗凈，放入60℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，破殼并入粉碎機內(nèi)粉碎，過60目篩，制得五味子果仁干粉，備用。

1.3.2冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽［13-14］

稱取5份5.000 g五味子果仁粉，按照一定的料液比分別加入100 mL一定濃度的冰醋酸，勻速攪拌20 min，于4℃條件下浸提1d后，置于4℃離心機中在一定轉(zhuǎn)速條件下離心20 min，取上清液，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將冰醋酸蒸干，冷凍干燥，滅菌水定容至10 mL，待進行抑菌試驗。

1.3.3單因素試驗

分別考察冰醋酸質(zhì)量分數(shù)（4%、6%、8%、10%和12%）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、離心速率（6 000 r/min、7 000 r/min、8 000 r/min、9 000 r/min和10 000 r/min）對冰醋酸法提取五味子果仁中抗菌肽對大腸桿菌抑菌效果的影響。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

表1　響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，利用Design-expert 8.0.6分析軟件的Box-Behnken中心組合設(shè)計法對冰醋酸質(zhì)量分數(shù)（A）、料液比（B）、離心速率（C）進行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化分析［17-19］。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

1.3.5抑菌活性測定

菌種活化：將大腸桿菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)基使菌種分散均勻，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，活化2～3次。

抑菌活性測定：抑菌活性采用瓊脂孔穴擴散法測定［20-21］。吸取濃度為120 CFU/mL活化的菌種120 μL加入LB固體培養(yǎng)基中，涂布均勻，在培養(yǎng)基上打直徑為5～6 mm的圓孔，用移液槍吸取50 μL抗菌肽粗提液加入孔洞。陰性對照組加50μL無菌蒸餾水，陽性對照組加50 μL 100 μg/mL的氨芐青霉素溶液。將培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h。觀察抑菌效果，并測量抑菌圈直徑（平行測定3次，取平均值）。

1.3.6試驗數(shù)據(jù)處理

運用軟件Design-Expert 8.0.6獲得回歸方程進行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1冰醋酸質(zhì)量分數(shù)對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響

圖1　冰醋酸濃度對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.1 Effect of glacial acetic acid concentration on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖1可知，在冰醋酸質(zhì)量分數(shù)為4%～10%范圍內(nèi)，隨著冰醋酸質(zhì)量分數(shù)的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)增長的趨勢；當冰醋酸質(zhì)量分數(shù)為10%時，抑菌圈直徑達到最大，為2.11 cm；當冰醋酸質(zhì)量分數(shù)＞10%時，抑菌圈直徑開始降低。因此，選擇冰醋酸質(zhì)量分數(shù)為10%較適宜。

2.1.2料液比對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，抑菌圈直徑呈先增長后減小的趨勢，當料液比為1∶30（g∶mL）時，抑菌圈直徑達到峰值，為2.03 cm；當料液比＞1∶30（g∶mL），溶出的抗菌肽含量開始出現(xiàn)了降低趨勢，抑菌圈直徑隨之降低，因此，選擇料液比為1∶30（g∶mL）較適宜。

圖2　料液比對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

2.1.3離心速率對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的作用

圖3　離心速率對五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影響Fig.3 Effect of centrifugal speed rate on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖3可知，抑菌圈直徑隨離心速率的提高先增加后降低。當離心速率為8 000 r/min時，抑菌圈直徑達到峰值，為2.06 cm；當離心速率的持續(xù)增加（＞8 000 r/min）會使提取出的五味子果仁抗菌肽在離心過程中有所損失，最終導(dǎo)致抑菌圈直徑開始降低，因此，選擇離心速率為8 000 r/min較適宜。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6分析軟件，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法，探討冰醋酸質(zhì)量分數(shù)（A）、料液比（B）、離心速率（C）及其交互作用對抑菌效果的影響，響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析如表2所示，響應(yīng)面數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of response surface experiments

續(xù)表

根據(jù)表2試驗結(jié)果，運用軟件Design-expert 8.0.6對響應(yīng)值進行多元回歸擬合應(yīng)進行方差分析，得到五味子果仁抗菌肽提取工藝參數(shù)回歸方程為：

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該二次方程模型具有顯著差異性（P＜0.05），R2=0.968 1，說明該模型擬合情況良好、可靠性較高。失擬項P值為0.060 0＞0.05，不顯著，表明試驗誤差較小，未知因素對試驗干擾少。因素A、A2、C2對抑菌效果有極顯著的影響（P＜0.00 1）；因素B、C、B2、物料比和離心速率的交互項（BC）對抑菌效果有顯著性的影響（P＜0.05）；冰醋酸濃度和料液比的交互項（AB）、冰醋酸濃度和離心轉(zhuǎn)速的交互項（AC）對抑菌效果影響不顯著（P＞0.05）。模型的信噪比為13.964＞4，表明選用響應(yīng)面模型合理的。

2.2.2響應(yīng)面交互作用結(jié)果分析

采用軟件Design-expert 8.0.6做兩兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線，確定冰醋酸質(zhì)量濃度、料液比和離心轉(zhuǎn)速對五味子果仁抗菌肽抑菌圈直徑的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　冰醋酸質(zhì)量分數(shù)、料液比和離心速率交互作用對五味子果仁抗菌肽抑菌圈直徑影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glacial acetic acid concentration，solid-liquid ratio and centrifugal speed rate on inhibitory zone diameter of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由圖4可知，當轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時，冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和料液比所形成的曲面向下傾斜的幅度較大，表明冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和料液比對所提取的SFA的抑菌作用影響極為顯著，當冰醋酸質(zhì)量分數(shù)為接近10%左右，料液比接近1∶30（g∶mL）時，抑菌圈直徑達到最大值。同時，等高線近乎于圓形時表明冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和離心速率的交互項對抑菌效果不顯著。當料液比為1∶30（g∶mL）時，冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和離心速率所形成的曲面出現(xiàn)陡坡，表明冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和離心速率對五味子果仁抗菌肽的抑菌作用極為顯著。冰醋酸質(zhì)量分數(shù)的不斷增加，抑菌圈大小先增加后減小。離心速率也表現(xiàn)出相同的規(guī)律。同時，圖中等高線近乎于圓形，表明冰醋酸質(zhì)量分數(shù)和離心速率的交互項對抑菌效果影響不顯著。當冰醋酸質(zhì)量分數(shù)為10%時，料液比和離心速率對SFA的抑菌效果影響顯著。不斷提升離心速率，抑菌效果先上升后下降。料液比與離心速率變化規(guī)律相似。

2.3冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽的最佳提取條件驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化，確定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為冰醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min，在此條件下，進行3次重復(fù)試驗，所得五味子果仁抗菌肽對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論值（2.10 cm）之間的相對誤差僅為1.09%，表明擬合方程符合實際，試驗所設(shè)計的最佳條件是準確可靠的。

3　結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析法，確定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工藝條件為冰醋酸質(zhì)量分數(shù)10%、料液比1∶28（g∶mL）、離心速率8 200 r/min。在此最佳條件下，所得五味子果仁抗菌肽對大腸桿菌抑菌圈直徑為2.13 cm，與理論計算值（2.10 cm）之間的相對誤差僅為1.09%，表明該模型能夠很好地預(yù)測實際的提取情況。對五味子綜合利用和新型抗菌肽的研究與開發(fā)具有重要意義。

［1］黃曉東，任曠.五味子木脂素研究進展［J］.吉林醫(yī)藥學院學報，2010， 31（1）：46-49.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學工業(yè)出版社. 2000：48，197.

［3］史琳，王志成，馮敘橋，等.五味子化學成分及藥理作用的研究進展［J］.藥物評價研究，2011，34（3）：208-212.

［4］李立順，時維靜，馬迅兵，等.北五味子種子和果肉中的活性成分比較［J］.食品科學，2012，33（16）：175-178.

［5］劉容旭，高辰哲，姜帆，等.五味子多糖對兩種腸道腫瘤細胞的抑制作用的影響［J］.食品科學，2015，36（5）：192-196.

［6］REDDY K V R，YEDERY R D，ARANHA C.Antimicrobial peptides：premises and promises［J］.Int J Antimicrob Agents，2004，24（6）：536-547.

［7］蘇翔，崔敬愛，陳曉平，等.螞蟻抗菌肽的分離純化及其活性［J］.食品科學，2013，34（9）：70-73.

［8］BULET P，ST?CKLIN R.Insect antimicrobial peptides：structures，properties and gene regulation［J］.Protein Peptide Lett，2005，12（1）：3-11.

［9］REDDY K V R，YEDERY R D，ARANHA C.Antimicrobial peptides：premises and promises［J］.Int J Antimicrob Agents，2004，24（6）：536-547.

［10］王軍，龐廣昌.抗菌肽抗菌機理的研究現(xiàn)狀及趨勢［J］.食品科學，2005，26（8）：526-528.

［11］陳曉平，詹冬玲，賈惠文，等.抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表達載體的構(gòu)建［J］.食品科學，2007，28（9）：395-397.

［12］李曉光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其藥理作用研究進展［J］.中藥材，2005，28（2）：156-159.

［13］王雅麗.中國林蛙皮膚抗菌肽的分離純化及生物活性研究［D］.長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2015.

［14］徐同玲.日本鰻鱺組織器官抗菌肽的分離與鑒定［D］.廈門：集美大學，2009.

［15］楊瑩瑩，陳曉平.響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜抑菌物質(zhì)超聲波提取工藝的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2012，48（4）：37-41.

［16］陳曉平，于翠翠.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助乙醇提取桑黃黃酮工藝的研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2013，49（4）：31-36.

［17］趙巖巖，李帥，陳曉平，等.響應(yīng)面法優(yōu)化浸提大蒜抑制大腸桿菌成分工藝［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34（5）：575-579，583.

［18］王永菲，王成國.響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用［J］.中央民族大學學報：自然科學版，2005，14（3）：236-239.

［19］楊文雄，高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.中國食品添加劑，2005（12）：68-71.

［20］梁英.抗菌肽的來源及應(yīng)用［J］.動物營養(yǎng)學報，2014，26（1）：7-16.

［21］沈萍，范秀容.微生物學實驗（第三版）［M］.北京高等教育出版社，1996：85-100.

WU Wei1，JIAO Yang2，CHEN Xiaoping2*
（1.Jilin Provincial Institute of Standards，Changchun 130022，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Using the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide onEscherichia colias response value，the glacial acetic acid extraction technology parameters of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts were optimized by the Box-Behnken central combination design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction conditions of antimicrobial peptide were glacial acetic acid concentration 10%，solid-liquid ratio 1∶28（g∶ml）and centrifugal speed rate 8 200 r/min.Under the conditions，the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide extracted onEscherichia coliwas 2.13 cm，compared with the theoretical value（2.10 cm），the relative error was only 1.09%.Results indicated that fitted equation was in accord with the actual，and the results was accurate and reliable.

response surface methodology；glacial acetic acid extraction；fructus schisandrae nuts；antibacterial peptide

TS201.3

0254-5071（2016）06-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.023

2016-036-21

吉林省重點科技攻關(guān)項目（20050212-6）

武威（1974-），女，高級工程師，本科，研究方向為食品安全與標準。

陳曉平（1963-）男，教授，博士，研究方向為食品生物化學與功能食品。