向雙全，黃應(yīng)予，劉麗娟，王蕾，候花寧，周瑩瑩

（1.甘肅省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，甘肅徽縣742308；2.金徽酒股份有限公司技術(shù)中心，甘肅徽縣742308）

大曲蛋白酶對(duì)固態(tài)釀酒發(fā)酵的影響

向雙全1，2，黃應(yīng)予1，2，劉麗娟2，王蕾2，候花寧2，周瑩瑩2

（1.甘肅省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，甘肅徽縣742308；2.金徽酒股份有限公司技術(shù)中心，甘肅徽縣742308）

在傳統(tǒng)濃香型固態(tài)釀酒工藝的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)影響釀酒出酒率的關(guān)鍵響應(yīng)因子進(jìn)行了研究和探討。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立了出酒率與糟醅酸度、糟醅水分、大曲蛋白酶活力組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并通過(guò)分析模型方程和響應(yīng)曲面得到本試驗(yàn)方案固態(tài)釀酒最佳條件，即糟醅酸度為1.9度，糟醅水分含量為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g。在此最佳條件下，出酒率達(dá)到47.3%。

酸度；水分；大曲蛋白酶；出酒率

大曲蛋白酶是一種復(fù)合型蛋白酶，具有在酸性、中性、堿性條件下保持酶活力的特點(diǎn)，它是制曲過(guò)程多種微生物的代謝產(chǎn)物［1-5］。在固態(tài)釀酒發(fā)酵過(guò)程中大曲蛋白酶具有促進(jìn)原料溶解、分解蛋白質(zhì)、生成氨基酸、提供氮源、促進(jìn)微生物繁殖生長(zhǎng)，降解酵母菌體、提高原料利用率、提供生香前驅(qū)物質(zhì)和風(fēng)味組分，協(xié)同其他微生物共發(fā)酵、抑制大量雜醇油的生成、提高原酒產(chǎn)量和質(zhì)量等重要作用［6-10］。

在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)原料利用率低，發(fā)酵結(jié)束后糟醅酸度、殘?zhí)恰堄嗟矸墼絹?lái)越高、出酒率和質(zhì)量下降的惡性循環(huán)狀態(tài)。究其主要原因：一方面是蛋白質(zhì)對(duì)淀粉的包裹作用，阻礙大曲液化酶、糖化酶對(duì)淀粉的充分水解；另一方面是由于蛋白質(zhì)未被水解，發(fā)酵需要的氮源嚴(yán)重缺乏，影響釀酒微生物的繁殖代謝，特別是酵母菌對(duì)氮源的需求［11］。大曲中蛋白酶活力適當(dāng)?shù)那闆r下，包裹淀粉的蛋白質(zhì)層結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，使淀粉被糖化；另一方面蛋白質(zhì)水解增加了氮源，有利于釀酒微生物，特別是酵母菌的代謝繁殖，糟醅的惡性狀況會(huì)逐漸改善，達(dá)到正常生產(chǎn)水平。本研究通過(guò)Design Expert 8.05b（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)［12-14］，優(yōu)化了大曲蛋白酶在固態(tài)釀酒中的最佳酸度和水分配合發(fā)酵條件，充分發(fā)揮其在固態(tài)釀酒發(fā)酵過(guò)程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

中溫大曲：宜賓市長(zhǎng)興酒廠；酸性蛋白酶（10萬(wàn)U/g）：山東隆大科技公司；高粱、大米、糯米、玉米、小麥、稻殼：湖北夢(mèng)晶米業(yè)公司。

蒸餾水、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、酪蛋白、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：普析通用公司；XPE105電子天平：梅特勒-托利多公司；DK-S14恒溫水浴鍋、DGG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；FZ102微型植物粉碎機(jī)：山東泰斯特儀器有限公司；5 L蒸酒設(shè)備：自制。

1.3方法

1.3.1工藝流程

糧粉→加水潤(rùn)糧→加入稻殼混勻→入甄蒸煮→出甄檢測(cè)糟醅水分、酸度→調(diào)節(jié)糟醅水分、酸度→加入調(diào)好蛋白酶活力的曲粉→裝袋密封→放入培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵→取出蒸酒

1.3.2操作要點(diǎn)原料粉碎

將5種糧食粉碎，過(guò)20目篩；按高粱∶大米∶糯米∶小麥∶玉米比例為38%∶22%∶20%∶12%∶8%進(jìn)行混合。大曲粉碎后過(guò)20目篩。

取1 kg混合糧粉，加入600 mL溫水潤(rùn)糧30 min，加入250 g熟稻殼，混勻，在蒸酒設(shè)備上大氣蒸煮70 min后出甄，出甄后加入80℃熱水。通過(guò)調(diào)整加入熱水的量來(lái)控制發(fā)酵糟醅水分；同時(shí)通過(guò)在熱水中加入不同量的乳酸來(lái)控制發(fā)酵糟醅的酸度。加入熱水燜潤(rùn)15 min后攤開(kāi)糟醅冷卻，當(dāng)溫度降至20℃時(shí)加入調(diào)好蛋白酶活力的大曲粉250g。最后收堆密封，放入27℃培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵10 d后取出發(fā)酵后糟醅。

1.3.3單因素試驗(yàn)

糟醅酸度對(duì)出酒率的素影響：設(shè)定糟醅水分含量為50%，大曲蛋白酶活力為10.0U，分別調(diào)整糟醅酸度為1.4度、1.7度、2.0度、2.3度、2.6度、2.9度，考察糟醅酸度對(duì)出酒率的影響。糟醅酸度的定義為10 g糟醅消耗0.10 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫摩爾數(shù)為糟醅酸度，消耗1 mmol氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為1度。

糟醅水分對(duì)出酒率的影響：設(shè)定糟醅酸度為1.5度，大曲蛋白酶活力為10.0 U，分別調(diào)整糟醅水分含量為46%、48%、50%、52%、54%、56%，考察糟醅水分含量對(duì)出酒率的影響。

大曲蛋白酶活力對(duì)出酒率的影響：設(shè)定糟醅水分含量為50%，糟醅酸度為1.5度，分別調(diào)整大曲蛋白酶活力為5.0 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g、30 U/g，大曲蛋白酶活力對(duì)出酒率的影響。大曲蛋白酶活定義為1 g（干質(zhì)量）大曲中所含的蛋白酶在40℃、pH值為3.0的條件下1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位（U/g）［15］。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)

采用Design Expert 8.05b軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選取發(fā)酵糟醅水分、糟醅酸度、大曲蛋白酶活力為3個(gè)評(píng)價(jià)因素，以出酒率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels of Box-Behnken design

1.3.5測(cè)定方法

出酒率：糟醅發(fā)酵10d后取出拌糠蒸餾，用500 mL量筒接酒，同時(shí)在量筒中放入溫度計(jì)和酒精計(jì)，當(dāng)量筒中的酒精度降至60%vol時(shí)，停止接酒，記錄蒸出酒體積，按60%vol酒精度計(jì)算出酒率。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1糟醅酸度對(duì)出酒率的影響

糟醅酸度對(duì)出酒率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，糟醅酸度為1.4～2.0度時(shí)，隨著酸度的增加，釀酒微生物繁殖代謝能力逐漸增強(qiáng)，出酒率也增加；當(dāng)糟醅酸度＞2.0度時(shí)，釀酒微生物繁殖代謝能力減弱，出酒率開(kāi)始下降。因此，確定出酒率最佳的糟醅酸度為2.0度。

圖1　糟醅酸度對(duì)出酒率的影響Fig.1 Effect of fermented grains acidity on Baijiuyield

2.1.2糟醅水分含量對(duì)出酒率的影響

糟醅水分含量對(duì)出酒率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，糟醅水分含量在46%～52%的范圍內(nèi)時(shí)，隨著水分含量的增加，出酒率也增加；當(dāng)水分含量＞52%時(shí)，出酒率開(kāi)始下降。因此，確定出酒率最佳糟醅水分為52%。

圖2　糟醅水分含量對(duì)出酒率的影響Fig.2 Effect of fermented grains moisture onBaijiuyield

2.1.3大曲蛋白酶活力對(duì)出酒率的影響

大曲蛋白酶活力對(duì)出酒率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，大曲蛋白酶活力在5～15 U/g的范圍內(nèi)時(shí)，隨著大曲蛋白酶活力的增加，出酒率也增加；當(dāng)大曲蛋白酶活力＞15 U/g時(shí)，出酒率開(kāi)始下降。因此，確定出酒率最佳的大曲蛋白酶活力條件為15 U/g。

圖3　大曲蛋白酶活力對(duì)出酒率的影響Fig.3 Effect of Daqu protease activity onBaijiuyield

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和顯著性分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)利用DesignExpert8.05b（Box-Behnken）軟件處理，用F（Fischer）檢驗(yàn)評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型方程的顯著性，方程的擬合性由決定系數(shù)R2確定，以確定固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中糟醅酸度、水分以及大曲蛋白酶活力的最佳配比，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：Y=2885.4-3.93A+1.84B-0.59C-0.30AB+ 0.35AC-0.17BC-8.87A2-3.29B2-4.34C2。用該回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，決定系數(shù)R2=0.973 2，說(shuō)明了97.32%的響應(yīng)值變化是由該模型決定的，調(diào)整后決定系數(shù)值為0.9384說(shuō)明試驗(yàn)中出酒率與模型預(yù)測(cè)值有93.84%的一致性，由此表明該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果能進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。模型的顯著水平P＜0.01，此時(shí)二次回歸方程是極顯著的，方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，因此可用此模型對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。通過(guò)比較方程一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小，可以判斷在本試驗(yàn)工藝參數(shù)中，糟醅酸度、二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），糟醅水分含量對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)對(duì)果影響不顯著（P＞0.05）。由表3可知A的P值為0.001，B的P值為0.000 2，C的P值為0.014 1，說(shuō)明各自變量在設(shè)定的取值范圍內(nèi)單因素對(duì)出酒率的影響順序?yàn)锳＞B＞C。失擬項(xiàng)P=0.1379＞0.05，未達(dá)到顯著水平，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，該模型能準(zhǔn)確描述各變量因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3響應(yīng)面的分析與優(yōu)化

通過(guò)模型方程得出的響應(yīng)曲面及等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，AC兩因素間的交互作用大于AB以及BC之間的交互作用；其結(jié)果與擬合方程中交互項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值大小關(guān)系一致。由圖4可以看出，等高線均呈橢圓形，說(shuō)明各兩因素間的交互作用較強(qiáng)。由此可以說(shuō)明在固態(tài)釀酒過(guò)程影響出酒率因素中，大曲蛋白酶活力的影響不可忽視，在固態(tài)釀酒工藝參數(shù)范圍內(nèi)大曲蛋白酶活力僅次于糟醅酸度對(duì)出酒率的影響，且大于糟醅水分對(duì)出酒率的影響，由此試驗(yàn)可以認(rèn)為大曲蛋白酶活力在固態(tài)釀酒過(guò)程中的重要作用及地位。

圖4　糟醅酸度、糟醅水分含量、大曲蛋白酶活力交互作用對(duì)出酒率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity onBaijiu yield

2.4模型驗(yàn)證

對(duì)擬合的二次多項(xiàng)式回歸方程分別求A、B、C的偏導(dǎo)數(shù)，可得各個(gè)因素的極值點(diǎn)：A=1.87，B=52.77，C=14.37。

即糟醅酸度1.87度，糟醅水分52.77%，大曲蛋白酶活力14.37 U/g。為方便實(shí)際操作，調(diào)整糟醅酸度為1.9度，糟醅水分為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，出酒率平均值為47.3%。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)根據(jù)傳統(tǒng)固態(tài)釀酒工藝控制要點(diǎn)的基礎(chǔ)上，固定其他工藝要素，選擇糟醅酸度、水分含量、大曲的蛋白酶活力3個(gè)因素，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)3因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了固態(tài)釀酒出酒率與糟醅酸度、水分含量、大曲蛋白酶活力組成的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并通過(guò)分析模型方程得到本試驗(yàn)方案固態(tài)釀酒最佳條件，即糟醅酸度為1.9度，糟醅水分含量為53%，大曲蛋白酶活力為14 U/g，在此條件下的出酒率為47.3%。

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XIANG Shuangquan1，2，HUANG Yingyu1，2，LIU Lijuan2，WANG Lei2，HOU Huaning2，ZHOU Yingying2
（1.Gansu Province Solid State Fermentation Engineering Technology Research Center，Huixian 742308，China；2.Provincial Technology Center of Jinhui Liquor Co.，Ltd.，Huixian 742308，China）

On the basis of traditional flavor type of solid-state fermentation process ofBaijiu，the key factors affectingBaijiuyield were researched by response surface methodology.Quadratic polynomial mathematical model was established betweenBaijiuyield and fermented grains acidity，moisture and Daqu protease activity by statistical method，and the optimal solid-state fermentation process was determined by analyzing model equations and response diagram as follows：fermented grains acidity 1.9，moisture 53%，Daqu protease activity 14 U/g.Under the optimum conditions，the Baijiuyield was 47.3%.

acidity；moisture；Daqu protease；liquor yield

TS261.1

0254-5071（2016）06-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.021

2016-04-23

甘肅省科技廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（144JTGK220）

向雙全（1979-），男，工程師，本科，研究方向?yàn)榘拙骑L(fēng)味成分和白酒釀造。