王強，李旭，竇少華，張慶芳，魏計東，金連豆，遲乃玉*

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產力促進中心，遼寧大連116025）

海洋葡甘聚糖酶菌株的分離鑒定及酶學性質研究

王強1，2，李旭3，竇少華1，2，張慶芳1，2，魏計東1，2，金連豆1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產力促進中心，遼寧大連116025）

以海泥和海水為樣品，采用稀釋涂布平板法初篩、搖瓶發(fā)酵復篩，得到一株葡甘聚糖酶高產菌Q1，測得酶活為187.68 U/mL。通過形態(tài)學、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其所產酶最適作用溫度為35℃，熱穩(wěn)定性較差；最適作用pH值為6.0，堿性條件下，pH穩(wěn)定性較差；Cu2+、Fe2+、乙二胺四乙酸（EDTA）對該酶抑制性較強，Mg2+對該酶抑制性較弱，NH4+對該酶的活性影響不明顯，Na+對該酶激活作用較弱，Mn2+對該酶激活作用較強。該酶只在外源誘導物存在時，才能大量合成，說明該酶是誘導酶。

海洋；葡甘聚糖酶；鑒定；枯草芽孢桿菌；酶學性質

葡甘聚糖酶（glucomannanase）是一種能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖的外泌酶。葡甘低聚糖屬于功能性低聚糖，功能性低聚糖因其具有獨特的生理功能而受到廣泛關注［1-2］。葡甘低聚糖具有極其顯著的降脂作用，可以作為高血脂、糖尿病輔助治療產品［3-5］；能提高體內超氧化物岐化酶活性，增強機體抗氧化能力［6］；具有排毒和增強免疫功能的作用［7］；促進腸道內有益微生物的生長，特別是耐氧雙歧桿菌的生長［8］。獲得葡甘低聚糖的方法主要有：從魔芋中提取，但是工藝復雜且產率極低；通過人工化學合成，但步驟繁瑣，成本太高；利用酸水解葡甘聚糖，但這樣生產的低聚糖性質不穩(wěn)定，副產品多；利用物理方法降解，但是實驗設備要求太高，無法用于大量生產［9］；酶解葡甘聚糖，反應效率高且方法簡單，后期分離也容易［10］。目前有關葡甘低聚糖產品，只有少量出現(xiàn)在國外市場，國內基本無此類產品［11］。

海洋微生物發(fā)酵生產低溫葡甘聚糖酶與中高溫葡甘聚糖酶相比具有很大優(yōu)勢，低溫葡甘聚糖酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用。本實驗從海洋樣品中分離篩選出一株葡甘聚糖酶產生菌Q1，對其進行形態(tài)學、生理生化特征及16S rDNA序列分析，進而確定其種屬，并研究其產生的葡甘聚糖酶酶學性質，為研究海洋微生物發(fā)酵生產葡甘聚糖酶奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

試驗菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Q1篩選自黃海海域（123.396°E，36.7014°N）海水和海泥樣品，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，魔芋粉0.5%，瓊脂2%，剛果紅適量，pH7.0，121℃滅菌20min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，魔芋粉0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

保藏培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑

魔芋粉：大連凱美化工工程配套有限公司；葡甘聚糖：合肥博美生物科技有限責任公司；核酸Marker：加拿大Fermentas MBI公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；HD-1360超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；A200型基因擴增儀：杭州朗基科學儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽經典科技有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離鑒定

（1）初篩

取10 mL海水和10 g海泥分別加入90 mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min。用無菌水從10-1依次梯度稀釋至10-8，分別取10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度樣品各0.1 mL，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍有無透明圈，篩選透明圈大的菌株進行后續(xù)實驗。

（2）復篩

將初篩得到的菌株接種到裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為一級種子液；

將一級種子液以5%接種量接種到裝液量為100 mL/ 250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為二級種子液。

將二級種子液以5%接種量接種到裝液量為100 mL/ 250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。通過3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定發(fā)酵液酶活，篩選出酶活高的菌株。

（3）形態(tài)學特征

在初篩培養(yǎng)基上觀察菌落的形狀、顏色等形態(tài)學特征，通過革蘭氏染色在光學顯微鏡（10×100）下觀察菌體形態(tài)。

（4）生理生化特征

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第8版）［12］相關內容，對該菌株進行淀粉水解、明膠液化、V-P試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗、糖發(fā)酵試驗、脲酶試驗、石蕊牛奶試驗、檸檬酸鹽試驗、硝酸鹽試驗。

（5）菌株16S rDNA序列分析

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。以提取到的菌株Q1 DNA為模板，以16S rDNA基因通用引物對16S rDNA序列片段進行聚合酶鏈反應（poly merase chain reaction，PCR）。其引物如下：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增反應體系模板（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq酶0.2 μL，正向引物27F（10 μmol/L）0.5 μL，反向引物1492R（10 μmol/L）0.5 μL，補加ddH2O至25 μL。擴增反應條件為94℃、4 min；94℃、45s，55℃、45s，72℃、1min，30個循環(huán)；72℃、10min。將PCR擴增產物送交上海生工生物有限公司測序，將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，經基本局部比對搜索工具（basic lacal aliqnment search tood，BLAST）序列比對，利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2葡甘聚糖酶酶活測定

DNS法測葡甘聚糖酶酶活［13］：0.9 mL 0.4%葡甘聚糖底物中，加入適當稀釋的葡甘聚糖酶酶液0.1 mL，30℃水浴10 min，立即放入100℃水浴5 min，終止反應，然后加入2.0mLDNS，100℃顯色5min，冷卻至室溫用蒸餾水定容至20 mL，于波長540 nm處測定吸光度值，根據(jù)酶活公式計算酶活。葡甘聚糖酶活單位定義：在上述反應條件下，葡甘聚糖每分鐘釋放1 μmol甘露糖的酶量為1個酶活單位（U）［14-15］。相對酶活以同組最高酶活為100%。

1.3.3粗酶液的制備

將二級種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經6 000 r/min、4℃離心20 min，所得上清液即為粗酶液。

1.3.4酶學性質研究

（1）酶最適作用溫度

取一定量酶液，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實驗。

（2）酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別置于35℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中，分別保存10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，立即冷卻，并測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實驗。

（3）酶最適作用pH

在酶最適作用溫度下，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0磷酸鉀緩沖液反應體系中測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實驗。

（4）酶的pH穩(wěn)定性

將酶液分別置于pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0磷酸鉀緩沖液中，分別保存10min、20min、30min、40min、50min、60min，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實驗。

（5）金屬離子與EDTA對酶活影響

在酶最適作用條件下，加入Cu2+、Mg2+、Fe2+、NH4+、Na+、Mn2+及乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使各反應體系中金屬離子終濃度為10 mmol/L，測定葡甘聚糖酶相對酶活，每次做3組平行實驗。

（6）判斷葡甘聚糖酶是否為誘導酶

第一步：將菌株Q1接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160r/min培養(yǎng)55 h，將發(fā)酵液經6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

第二步：收集發(fā)酵液中離心菌體，用磷酸鉀緩沖液懸浮菌體，6 000 r/min，4℃離心5 min，收集菌體，再次用磷酸鉀緩沖液將菌體懸浮，重復3次，將洗好菌體接種到種子培養(yǎng)基（無葡甘聚糖類物質）中，26℃、160 r/min培養(yǎng)55 h，將種子液經6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

第三步：收集種子液中離心菌體，用磷酸鉀緩沖液懸浮菌體，6 000 r/min、4℃離心5 min，收集菌體，再次用磷酸鉀緩沖液將菌體懸浮，重復3次，將洗好菌體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160 r/min培養(yǎng)55 h，將發(fā)酵液經6 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液測定酶活。

2　結果與分析

2.1菌株的篩選

對黃海海域海水和海泥樣品進行初篩和復篩，得到10株具有葡甘聚糖酶活性的菌株，其酶活如表1所示。

表1　菌株產酶活性比較Table 1 Comparison of enzyme activity produced by strains

由表1可知，葡甘聚糖酶酶活最高的是菌株Q1，酶活為187.68 U/mL，與國內一些研究報道相比，菌株Q1所產葡甘聚糖酶酶活高于董桂清［16］報道的菌株DK3所產酶酶活58.54 U/mL、吳華偉等［17］報道的菌株MAN所產酶酶活101 U/mL、程愛芳等［18］報道的菌株HD-1所產酶酶活72.6 U/mL。利用甘油保藏法將菌株Q1保藏于-20℃冰箱中，用于后續(xù)實驗。

2.2菌株Q1形態(tài)學特征

菌株Q1的菌落特征及革蘭氏染色結果見圖1。由圖1A可知，菌株Q1菌落邊緣不規(guī)則，乳白色，不透明，表面干燥，呈褶皺狀，用接種環(huán)易于挑取。由圖1B可知，菌株Q1為革蘭氏陽性菌，桿狀，菌體兩端生有芽孢。

圖1　菌株Q1菌落形態(tài)（A）及顯微形態(tài)（B）Fig.1 Colonial morphology（A）and microscopic morphology（B）of strain Q1

2.3生理生化特征

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（第8版）對菌株進行生理生化試驗，結果如表2所示。

表2　菌株Q1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Q1

由表2可知，菌株Q1生理生化特征為：淀粉水解試驗、明膠液化試驗、石蕊牛奶試驗、V-P試驗、接觸酶試驗、檸檬酸鹽試驗、硝酸鹽試驗結果均為陽性，脲酶試驗、糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗結果均為陰性。由生理生化試驗結果可初步鑒定其為芽孢桿菌屬。

2.416S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

選擇產葡甘聚糖酶酶活最高的菌株Q1進行16S rDNA序列鑒定，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將得到的基因組作為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，PCR擴增產物序列長度為1 486 bp。

以菌株Q1的16SrDNA序列為基基，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性最高的己知分類菌株序列進行比較，以軟件構建菌株Q1系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。由圖3可知，菌株Q1與枯草芽孢桿菌同源性最高為100%，因此可以鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖2　菌株Q1 16S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification products electrophoresis of 16S rDNA ofstrain Q1

圖3　菌株Q1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Q1 based on 16S rDNA sequence

2.5酶學性質研究

2.5.1酶最適作用溫度

由圖4可知，酶的最適作用溫度為35℃，40℃以后酶活迅速下降，在20～35℃下酶活能保持在80%以上，這符合低溫酶的特性。在低溫條件下，相對嗜溫型酶而言，低溫酶反應所需時間更短，這是低溫酶的應用優(yōu)勢［19］。

圖4　葡甘聚糖酶最適作用溫度Fig.4 The optimum temperature of the glucomannanase

2.5.2酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，該葡甘聚糖酶熱穩(wěn)定性比較差，經60℃處理30 min，酶活不足20%，70℃處理30 min，酶活不足10%。原因可能是低溫酶結構的高度柔順性可能造成蛋白的離子配位松散，并且由于缺乏二硫鍵及剛性的二級結構，導致低溫酶對熱變性和化學變性敏感，穩(wěn)定性降低［20］。

圖5　葡甘聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermostability of the glucomannanase

2.5.3酶最適作用pH

在同一溫度下，不同的pH對于相對酶活會產生不同的影響。由圖6可知，該葡甘聚糖酶最適反應pH為6.0，pH值為5.0～6.0時，葡甘聚糖酶相對酶活均在80%以上，pH值為7.0～11.0時，相對酶活呈下降趨勢；pH達到11.0時，相對酶活幾乎為零。

圖6　葡甘聚糖酶最適作用pHFig.6 The optimum pH of glucomannanase

2.5.4酶的pH穩(wěn)定性

由圖7可知，該葡甘聚糖酶最適作用pH為6.0，經pH 5.0處理30 min，相對酶活仍為80%以上；pH 8.0處理30 min，相對酶活僅為20%；pH 9.0處理30 min，相對酶活不足10%，故該酶具有一定耐酸性，堿性條件下，pH穩(wěn)定性較差，這是由于酶分子中所含的酸性氨基酸比率偏高導致的。

圖7　葡甘聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of the glucomannanase

2.5.5金屬離子和EDTA對酶活的影響

由表3可知，Cu2+、Fe2+、EDTA對酶的抑制性較強，Mg2+對酶的抑制性較弱，NH4+對酶作用不明顯，Na+對酶有較弱的激活作用，Mn2+對酶有較強的激活作用。該酶能被EDTA強烈抑制，可以推測該酶的活性中心構象的維持與金屬離子有關［21］。

表3　金屬離子與EDTA對葡甘聚糖酶活性的影響Table 3 Effects of metal ions and EDTA on the activity of glucomannanase

2.5.6判斷葡甘聚糖酶是否為誘導酶

在沒有外源誘導物（葡甘聚糖類物質）時，沒有葡甘聚糖酶合成，即在種子液中檢測不到葡甘聚糖酶活性，只有在以葡甘聚糖類物質為唯一碳源時，葡甘聚糖酶大量合成，即在發(fā)酵液中測得葡甘聚糖酶活性，說明該酶為誘導酶。

3　結論

本實驗是從黃海海域的海泥和海水樣品中，初篩得到10株葡甘聚糖酶菌株，DNS法測定酶活進行復篩，得到一株酶活較高的菌株Q1，并對其進行形態(tài)學、生理生化特征、16SrDNA序列分析，鑒定菌株Q1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。對其所產的葡甘聚糖酶酶學性質進行初步研究，結果表明，該酶的最適作用溫度為35℃，酶的熱穩(wěn)定性較差，屬于低溫酶類；酶的最適作用pH為6.0，該酶在堿性條件下穩(wěn)定性較差；Cu2+、Fe2+、EDTA對酶的抑制性較強，Mg2+對酶的抑制性較弱，NH4+對酶作用不明顯，Na+對酶有較弱的激活作用，Mn2+對酶有較強的激活作用；葡甘聚糖酶只在以葡甘聚糖類物質為唯一碳源的條件下才能合成，說明該酶為誘導酶。

［1］張雪云.功能性低聚糖的研究開發(fā)［J］.飲料工業(yè)，2013，16（1）：5-8.

［2］鐘燕，索化夷.魔芋葡甘聚糖的功能及在食品領域的應用［J］.中國釀造，2014，33（8）：6-9.

［3］何丹，郭熊，楊雙蓮，等.酶法制備魔芋甘露寡糖和產物分析［J］.中國釀造，2013，32（5）：85-88.

［4］陳黎，楊艷燕，閆達中.魔芋低聚糖降脂作用的初步探究［J］.中國生化藥物雜志，2002，23（4）：181-182.

［5］FUKUMORI Y，TAKEDA H，F(xiàn)UJISAWA T，et al.Blood glucose and insulin concentrations are reduced in humans administered sucrose with inosine or adenosine［J］.J Nutr，2000，130（8）：1946-1949.

［6］楊艷燕，李小明，李順意，等.魔芋低聚糖對小鼠血糖含量和抗氧化能力的影響［J］.中草藥，2001，32（2）：142-145.

［7］馮莉，劉瑞雪，張波，等.魔芋低聚糖作為新食品原料的應用研究［J］.中國食品添加劑，2014（7）：153-157.

［8］吳擁軍，王嘉福，蔡金藤，等.魔芋葡萄甘露低聚糖的提取及其產物對耐氧雙歧桿菌的促生長作用［J］.食品科學，2002，23（6）：42-44.

［9］周海燕，楊三東，周大寨，等.發(fā)酵生產魔芋葡甘聚糖酶［J］.中國生物工程雜志，2005，25（3）：65-68.

［10］郁蓉，王歲樓.酶法制備功能性低聚糖的研究進展［J］.中國食品與營養(yǎng)，2009（12）：32-35.

［11］陳堅.微生物重要代謝產物—發(fā)酵生產與過程分析［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：6.

［12］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001：43-65.

［13］馮娜，趙君，趙敏.β-甘露聚糖酶產生菌DY-14的發(fā)酵條件及分離純化［J］.黑龍江醫(yī)藥，2011（3）：397-401.

［14］李江華，房俊，鄔顯章.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的搖瓶發(fā)酵條件［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2002，12（4）：16-18.

［15］陳思洋.發(fā)酵法生產魔芋葡甘聚糖酶［D］.長沙：湖南農業(yè)大學，2012.

［16］董桂清.產葡甘聚糖酶菌株的篩選及酶的分離純化［D］.南寧：廣西大學，2007.

［17］吳華偉，蔚鑫鑫，陳雪秋，等.產甘露聚糖酶細菌的分離鑒定、酶的部分純化及酶學性質研究［J］.湖北農業(yè)科學，2014，53（15）：3601-3605.

［18］程愛芳，鄧政東，黃芳一，等.多黏芽孢桿菌HD-1產β-甘露聚糖酶的條件優(yōu)化［J］.湖北農業(yè)科學，2015（1）：164-167.

［19］司馬義·薩依木.極端環(huán)境中的低溫微生物及其應用［J］.生物學通報，2002，37（8）：15-17.

［20］曾胤新，蔡明宏，余勇，等.微生物低溫酶適冷機制研究進展［J］.中國生物工程雜志，2003，23（10）：52-56.

［21］張金偉，曾潤穎.南極產低溫脂肪酶菌株Psychrobactersp.7195的選育、發(fā)酵條件及酶學性質研究［J］.生物磁學，2006，6（1）：6-10.

WANG Qiang1，2，LI Xu3，DOU Shaohua1，2，ZHANG Qingfang1，2，WEI Jidong1，2，JIN Liandou1，2，CHI Naiyu1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center，Dalian 116622，China；3.Dalian Productivity Promote Center，Dalian 116025，China）

Using sea mud and seawater as samples，a high glucomannanase-producing strain Q1 was obtained by spread plate method preliminary screening and shake flask fermentation secondary screening，and the enzyme activity was 187.68 U/ml.The strain Q1 was identified asBacillus subtilisby morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The optimum temperature of glucomannanase production was 35℃and the thermostability was weaker.The optimum pH was 6.0，pH stability was weaker in alkaline condition.The glucomannanase activity was strongly inhibited by Cu2+、Fe2+and EDTA，slightly inhibited by Mg2+.The effect of NH4+on the glucomannanase activity was not obvious.The glucomannanase activity was slightly activated by Na+，strongly activated by Mn2+.Only in the exogenous inducer condition，the glucomannanase could be synthesized in quantity，which indicated that the glucomannanase was inducible enzyme.

marine；glucomannanase；identification；Bacillus subtilis；enzymatic properties

Q93

0254-5071（2016）06-0065-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.014

2016-04-01

國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（2007AA021306）

王強（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物酶制劑研究。

遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向為微生物酶制劑研究。