徐佳，邱樹(shù)毅，周鴻翔，班世棟，王曉丹，*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

醬香大曲中可培養(yǎng)的冠突散囊菌的初步研究

徐佳1，2，邱樹(shù)毅1，2，周鴻翔1，2，班世棟3，王曉丹1，2，3*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

采用平板涂布法從醬香大曲中分離篩選霉菌，結(jié)合形態(tài)觀察和真菌16S rDNA-ITS基因序列同源性比對(duì)分析，對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行鑒定。根據(jù)大曲功能和散囊菌特點(diǎn)，測(cè)定該菌酶活力；采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)固態(tài)發(fā)酵的揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行分析。篩選分離得到一株散囊菌，歸類并命名為冠突散囊菌（Eurotium cristatus），該菌的酸性蛋白酶、脂肪酶、果膠酶酶活力較高，分別為594.62 U/g，45.29 U/g和410.26 U/g；固態(tài)發(fā)酵物具有花香和果菜香，揮發(fā)性香味物質(zhì)以高級(jí)醇、酮和呋喃類為主體，其中L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-戊基呋喃是主要的呈香物質(zhì)。分離得到的冠突散囊菌的產(chǎn)酶特點(diǎn)和產(chǎn)香功能反映了霉菌在醬香型大曲中的重要作用。

醬香大曲；冠突散囊菌；酶活；香氣成分

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名冠突曲霉，為子囊菌門(mén)不整囊菌綱散囊菌目散囊菌科散囊菌屬的真菌，是曲霉屬霉菌小冠曲霉的有性型名稱［1］，主要存在于中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵茶茯磚茶中，土壤、冬蟲(chóng)夏草、中藥材和木屑也有分布。該菌與同屬內(nèi)其他種的區(qū)別是在查氏瓊脂上可正常生長(zhǎng)，子囊孢子具冠狀突起及粗糙具尖疣的表面，但由于該菌子囊孢子的形態(tài)特征不是很穩(wěn)定［2］，所以冠突散囊菌種名的鑒定一直存在爭(zhēng)議。目前中國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造微生態(tài)中，張良等［3］曾在研究濃香型白酒瀘州老窖古釀酒作坊空氣中微生物時(shí)有發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌，其研究表明，作坊空氣中冠突散囊菌在數(shù)量上最多，對(duì)其產(chǎn)酶進(jìn)行了試驗(yàn)，證明該菌脂肪酶活性較高。而在茯磚茶的研究中，冠突散囊菌具有良好的產(chǎn)酶能力，能分泌多酚氧化酶［55］、果膠酶、纖維素酶［4］、脂肪酶、淀粉酶［5］、蛋白酶［5-6］等胞外酶，對(duì)原材料進(jìn)行降解，同時(shí)還能生成冠突散囊菌特有的“菌花香”［7］。虞飛［8］還在以冠突散囊為優(yōu)勢(shì)菌的茯磚茶中檢測(cè)到大量吡嗪類醬味物質(zhì)。

醬香大曲具有糖化和生香的作用，微生物是制曲過(guò)程中糖化發(fā)酵的動(dòng)力，也是大曲醬香的來(lái)源［9］。微生物能分泌多種水解酶進(jìn)而分解原料得到可發(fā)酵性糖和一些氨基酸，在制曲過(guò)程中還能生成一些醬香物質(zhì)，從而達(dá)到大曲的生香作用［10］。霉菌是組成大曲微生物的主要菌群之一，目前從醬香大曲分離到的霉菌種類較多，能分泌活性較高的糖化酶、蛋白酶等多種酶，也是實(shí)現(xiàn)糖化發(fā)酵的關(guān)鍵微生物［11］，可以促進(jìn)大曲的成熟；同時(shí)能生成酸、醇、酯等風(fēng)味物質(zhì)［9］，對(duì)大曲的香味有積極貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)從醬香大曲中分離霉菌，經(jīng)過(guò)研究其形態(tài)，并結(jié)合大曲的功能來(lái)探討分離霉菌的特性，為研究大曲霉菌在釀造中發(fā)揮的作用提供更多的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1大曲

醬香型大曲來(lái)自貴州某酒廠儲(chǔ)存6個(gè)月粉碎后的釀酒車間生產(chǎn)用曲。

1.1.2主要試劑

植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、NaCl、K2HPO4、KCl、瓊脂：成都金山化學(xué)試劑有限公司；NaNO3、MgSO4·7H2O：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基（Czapek agar medium，CAM）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：均購(gòu)于上海博威科技有限公司。

20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基［2］：蔗糖20 g，NaNO30.2 g，K2HPO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，F(xiàn)eSO40.001g，瓊脂2 g，溶于100 mL水，121℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基［12］：麩皮15 g，加入15 mL水，攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

高粱小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基［13］：高粱與小麥各15 g，加入10 mL水，攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

S-3400N掃描電鏡：日本HITACHI（日立）公司；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；手動(dòng)固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司；6890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1霉菌的分離純化

稱取10 g大曲加入含有玻璃珠的90 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩30 min，取原液1 mL梯度稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5，進(jìn)行平板涂布，然后放入32℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，多次劃線分離鏡檢無(wú)雜菌后即為純化菌種，將純化菌種轉(zhuǎn)接斜面保存，并編號(hào)。

1.3.2霉菌的的鑒定

（1）菌株FBKL3.0002的形態(tài)學(xué)鑒定

將已純化的FBKL3.0002菌株分別接種到CAM和20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)20 d左右，觀察菌落的形態(tài)特征，挑取少量菌體做前處理后，制片在S-3400N掃描電鏡下觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征，通過(guò)《中國(guó)真菌志》［2］及相關(guān)文獻(xiàn)［1］對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

（2）霉菌的分子生物學(xué)鑒定

將分離純化的霉菌接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，30℃條件下在搖床中培養(yǎng)5～7 d，然后收集菌絲球，測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成，用植物DNA基因組試劑盒提取DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（polyuerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增采用真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS4（5'TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC3'）和ITS5（5'GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG3'），并將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3冠突散囊菌粗酶液的制備

將冠突散囊菌接種到PDA斜面上30℃培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水洗下孢子，之后以10%的接種量接種到麩皮培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3 d，所得培養(yǎng)物與水混合（1∶10，g∶mL）攪勻，40℃水浴1 h，每隔15 min攪拌一次，過(guò)濾，所得濾液為粗酶液。

1.3.4冠突散囊菌的酶活測(cè)定

糖化型淀粉酶活力測(cè)定：采用3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法［14］；酸性蛋白酶活力測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》［15］；脂肪酶活力測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》［16］；纖維素酶活力測(cè)定：參照文獻(xiàn)［17］；果膠酶活力測(cè)定：采用輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 1502—1992《果膠酶制劑》［18］。

1.3.5冠突散囊菌固體發(fā)酵產(chǎn)物的香氣成分測(cè)定

取培養(yǎng)7 d的冠突散囊菌斜面試管一支，用10 mL的無(wú)菌水洗下，然后以10%的接種量接入高粱與小麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7～9 d。均勻取樣品約10 g，置于50 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入手動(dòng)進(jìn)樣器，在溫度120℃左右頂空萃取40 min后取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，熱解吸3 min進(jìn)樣。

色譜柱：ZB-5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm× 0.2 μm），柱溫40℃（保留2 min），以5℃/min升溫至270℃，運(yùn)行時(shí)間：48 min；汽化室溫度：250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓52.54 kPa，載氣流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：1 min。

氣相色譜條件：電子電離（elctronic ionization，EI）源，離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 294 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

2　結(jié)果與分析

2.1霉菌的分離篩選及鑒定結(jié)果與分析

采用常規(guī)的平板涂布分離方法，根據(jù)霉菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)具有的不同形態(tài)特征，從醬香型白酒大曲中共分離純化得到9株霉菌。通過(guò)對(duì)16S rDNA-ITS區(qū)域測(cè)序并在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）比對(duì)鑒定，可將所得9株菌劃分為7屬，即2株為犁頭霉屬霉菌、1株毛霉屬霉菌、1株曲霉屬霉菌、1株青霉屬霉菌、1株擬青霉屬霉菌、1株紅曲霉屬霉菌、2株散囊菌屬霉菌，其中除散囊菌屬霉菌，其它屬霉菌在各種醬香型白酒大曲中均有存在，是醬香大曲制曲過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，也是本實(shí)驗(yàn)大曲的重要霉菌類群。實(shí)驗(yàn)還分離到散囊菌屬霉菌，其中1株散囊菌已保藏于貴州大學(xué)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，并編號(hào)：FBKL3.0002。該菌在醬香酒釀造微生態(tài)中分離報(bào)道的較少，對(duì)其研究的很少，因此本課題將對(duì)該菌進(jìn)行全面的鑒定，并結(jié)合大曲的功能，對(duì)該菌在釀造過(guò)程中的特性做進(jìn)一步研究。

2.1.1菌株FBKL3.0002的形態(tài)學(xué)特征

通過(guò)平板劃線分離純化，按照《中國(guó)真菌志》的形態(tài)觀察培養(yǎng)方法，將得到的FBKL3.0002菌株接種在CAM和20%蔗糖查氏瓊脂培養(yǎng)基上觀察其菌落形態(tài)，并收集少量菌體進(jìn)行電鏡掃描，其結(jié)果如圖1所示。

圖1　菌株FBKL3.0002在CAM培養(yǎng)基的形態(tài)（A）、分生孢梗莖（B）、分生孢子頭（C）、閉囊殼（D）、子囊孢子（E）及分生孢子（F）的掃描電鏡圖Fig.1 SEM of colony morphology（A），conidiophore stem（B），conidiophore head（C），cleistothecium（D），ascospores（E）；conidium（F）of strain FBKL3.0002 on CAM medium

由圖1A可知，觀察到該菌在CAM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，25℃10～12 d直徑20 mm；周邊黃色，近于橄欖淺黃色，內(nèi)部顏色較深，近于橄欖褐至丁香褐色，老后變成褐色；可見(jiàn)大量黃色閉囊殼產(chǎn)生，分生孢子結(jié)構(gòu)不明顯。菌落在20%蔗糖查氏瓊脂上生長(zhǎng)較快，特征與在CAM上者相同。分生孢梗莖直立、光滑，如圖1-B所示；分生孢子頭幼時(shí)球形，老后呈疏松放射形，直徑可達(dá)140 μm，少數(shù)呈疏松短柱形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，如圖1-C所示；閉囊殼球形或近球形，黃色，直徑（100～200）μm，成熟較快，如圖1-D所示；子囊孢子雙凸鏡形，具兩個(gè)明顯的縱向雞冠狀突起，寬約（0.8～1.0）μm，孢子體（5～6）μm×（4～5）μm，凸面不平粗糙，具尖疣，如圖1-E所示。分生孢子橢圓形，少數(shù)近球形，（4.0～4.8）μm×（3.2～4.0）μm，壁粗糙，具小刺，如圖1-F所示。將該菌初步鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatus）。

2.1.2菌株FBKL3.0002的分子生物學(xué)鑒定

將送至上海生工得到的菌株FBKL3.0002的ITS區(qū)域測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Nucleotide blast比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株FBKL3.0002的ITS片段為520 bp，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Eurotium cristatum（Sequence ID：KM388844）相似度達(dá)到100%。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2，由圖2可知，菌株FBKL3.0002與Eurotium cristatum處于同一分支，進(jìn)一步鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

圖2　菌株FBKL3.0002系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain FBKL3.0002

2.2菌株FBKL3.0002的產(chǎn)酶活性

表1　冠突散囊菌5種酶活力測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of five enzymes activity of Eurotium cristatum

根據(jù)醬香大曲的酶活體系及霉菌在釀造過(guò)程中具有的5種代表性酶對(duì)該菌的產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究，其產(chǎn)酶活力如表1所示。由表1可知，在所測(cè)定的5種酶中，其均表現(xiàn)出一定的活性，表明該菌在大曲中具有產(chǎn)酶能力，對(duì)大曲的酶活體系具有貢獻(xiàn)作用。如表1所示，各種酶的酶活力差異較大，酸性蛋白酶、果膠酶、脂肪酶有較高活性，其他酶總體表現(xiàn)得相對(duì)較低。其中酸性蛋白酶活力最高，達(dá)到594.62 U/g，這與在釀酒的酸性環(huán)境中霉菌以主產(chǎn)酸性蛋白酶相符合；果膠酶活力為410.26 U/g，有助于降低原料的黏度，并與纖維素酶協(xié)同作用，提高原料中淀粉的利用率；脂肪酶活力為45.29 U/g，活性較高，這與在首次從濃香型白酒空氣中發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌時(shí)研究其產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果相似，這對(duì)霉菌生成香味物質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)；而其他酶相對(duì)活力表現(xiàn)一般，但對(duì)大曲酶系還是具有積極貢獻(xiàn)。

2.3冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵物香氣成分

冠突散囊菌進(jìn)行了模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行了測(cè)定。揮發(fā)性成分總離子流色譜圖見(jiàn)圖3，部分化合物的香味成分及含量見(jiàn)表2。

圖3　冠突散囊菌固體發(fā)酵物揮發(fā)性香味成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatogram of the aromatic compounds of Eurotium cristatumsolid-state fermentation

表2　冠突散囊菌揮發(fā)性成分中呈香物質(zhì)及相對(duì)含量Table 2 Aromatic compounds and relative content of Eurotium cristatumsolid-state fermentation

結(jié)果表明，該菌發(fā)酵產(chǎn)物共檢測(cè)出36種化合物，鑒定出26種化合物，有10種化合物未知，鑒定出的16種已知化合物見(jiàn)表2。由表2可知，呈香物質(zhì)在種類上大概可分為醛類、醇類、酮類、呋喃、烯烴類物質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)物中以醇、酮和呋喃類物質(zhì)為主，其種類和相對(duì)含量最多，也是主要的呈香物質(zhì)。

在鑒定的26種化合物中有16種物質(zhì)具有香味，占總揮發(fā)性成分的77.50%，它們主要是醇、酮和呋喃類物質(zhì)，可以提供多種香味，以花香與果菜香為主體香。醇類是主要的呈花香化合物，其中L-芳樟醇相對(duì)含量最高，達(dá)到28.32%，該物質(zhì)屬于具有濃烈花香味的天然香料物質(zhì)，香氣柔和，輕揚(yáng)透發(fā)，不甚持久，是重要的花香味物質(zhì)；而1-辛烯-3-醇具有蘑菇香味，它存在于日本松蕈和蘑菇中，是蘑菇散發(fā)出來(lái)的重要香味物質(zhì)，其相對(duì)含量可達(dá)13.18%。呋喃類和酮類化合物是主要的呈水果香物質(zhì)，2-戊基呋喃具有果香與甜香，相對(duì)含量最高為6.75%，2-正丙基呋喃也具有果香；二甲基丁酮具有香蕉味，2-壬酮除具有果香，還含有油脂香，它們相對(duì)含量分別為3.22%與1.54%。該菌除了能提供花香和果菜香外，還能提供一些其他香，如2-丁醇、2-甲基呋喃具有巧克力香，二甲基丁醛、己醛、芳樟醇氧化物具有輕淡的青草香，3-辛酮還具有樹(shù)脂香，相對(duì)含量可達(dá)10.86%。由以上結(jié)果可以看出，該菌具有產(chǎn)花香和果菜香的能力，醇、酮和呋喃類是其主要的呈香載體物質(zhì)，這對(duì)形成具有多種風(fēng)味物質(zhì)的醬香酒可產(chǎn)生一定的貢獻(xiàn)，可作為重要的產(chǎn)香功能菌。

3　結(jié)論

采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，從醬香大曲分離到1株散囊菌屬霉菌FBKL3.0002。通過(guò)形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定，其鑒定結(jié)果為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

實(shí)驗(yàn)對(duì)冠突散囊菌的糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶活力進(jìn)行了測(cè)定，各種酶活分別為288.13 U/g、594.62 U/g，45.29 U/g、3.29 U/g和410.26 U/g，其中酸性蛋白酶、果膠酶、脂肪酶有較高活性，其他酶總體表現(xiàn)得相對(duì)較低，但各種酶對(duì)大曲酶系還是具有積極貢獻(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵物的揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行分析，該菌具有產(chǎn)香能力，其中以產(chǎn)花香和水果香為主，醇、酮和呋喃類是主要的呈香物質(zhì)，對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)形成有貢獻(xiàn)。

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［17］趙玉萍，楊娟.四種纖維素酶酶活測(cè)定方法的比較［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（3）：116-118.

［18］輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所.QB 1502—1992果膠酶制劑［S］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1993.

XU Jia1，2，QIU Shuyi1，2，ZHOU Hongxiang1，2，BAN Shidong3，WANG Xiaodan1，2，3*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor-making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Molds were screened from Moutai flavor Daqu，and then identified by dilution plate coating method，combining with morphology observation and fungal 16SrDNA-ITS gene sequence homology comparison analysis.According to the function of Daqu and the characteristics ofEurotium sp.，the enzyme activity of the strain was determined.Using SPME-MS technique，the volatile substances of the solid-state fermentation were analyzed.The results showed that aEurotium cristatuswas screened，and the enzyme activity of its acid protease，lipase，pectinase were 594.62 U/g，45.29 U/g and 410.26 U/g，respectively.The substances of solid-state fermentation of the strain has floral and fruity flavor，and the main volatile flavoring substances were mainly higher alcohols，ketones，and furan.L-linalool，1-octene-3-alcohol，3-symplectic ketones and 2-amyl furan were the dominating aroma-producing substance.The enzyme production characteristics and aroma production function of the isolatedE.cristatusreflected the important role of mold in Moutai-flavor Daqu.

Moutai-flavor Daqu；Eurotium cristatus；enzyme activity；aroma components

TS201.3

0254-5071（2016）06-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.012

2016-02-16

貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字［2014］3012）；貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字［2013］6009號(hào)）；貴州省省校合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字［2014］7672）

徐佳（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。

王曉丹（1980-），實(shí)驗(yàn)師，博士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。