唐艷斌，段曉艷，王麗娟，陳頔，楊蕾

（1.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，國家衛(wèi)生計生委微量元素重點實驗室，北京100050；2.云南同創(chuàng)檢測技術股份有限公司檢測事業(yè)部，云南昆明650106；3.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650031）

麥角甾醇含量檢測分析柑橘真菌污染程度的方法研究

唐艷斌1，段曉艷3，王麗娟1，陳頔1，楊蕾2*

（1.中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所，國家衛(wèi)生計生委微量元素重點實驗室，北京100050；2.云南同創(chuàng)檢測技術股份有限公司檢測事業(yè)部，云南昆明650106；3.云南師范大學生命科學學院，云南昆明650031）

建立了以7-去氫膽固醇為內(nèi)標，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法同步選擇離子檢測/全掃描的定量檢測方法，并采用該方法檢測了不同程度霉變的柑橘中的麥角甾醇含量，確定柑橘的真菌污染程度。結果表明，麥角甾醇在5～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系（R2=0.999 9）；檢出限和定量限分別為3.12 mg/kg、10.39 mg/kg，加標回收率范圍在91.33%～100.14%，日內(nèi)相對標準偏差為0.04～0.49%、日間相對標準偏差為0.22%。該方法簡便、靈敏、準確，麥角甾醇含量可作為柑橘早期受真菌侵染的重要指標。

麥角甾醇；柑橘；真菌侵染；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，具有較高營養(yǎng)價值、藥用價值和保健作用［1］。我國柑橘的產(chǎn)銷量為世界第一，以鮮果銷售為主，而柑橘的生產(chǎn)地較為分散，且離城市較遠，成熟期相對集中。因此，柑橘采收后需要經(jīng)過一定的儲藏和運輸周期，在這一段時期，柑橘鮮果的品質(zhì)受到諸多因素的影響而惡化，如柑橘果肉組織的生理變化失調(diào)或衰老、采收、包裝或運輸過程中的機械損傷以及病原微生物的侵染等。水果的采后病害導致巨大損失是一個全球性的問題，其中微生物的侵染是其中最主要的原因［2］。柑橘貯藏病害主要由真菌引起，由意大利青霉（Penicillium italicum）引起的青霉病和指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病的腐爛最為嚴重［3-4］。每年因病害造成柑橘腐爛損失率高達10%～30%，嚴重的竟達到60%以上［2］。因此，對柑橘受真菌侵染情況進行測定，采取有效措施進行病害的防治是非常有必要的。

當前，對柑橘是否受真菌侵染的檢測一般采用肉眼觀察是否長出真菌菌絲體、鼻聞是否出現(xiàn)霉味等感官手段［5-9］，或者通過對真菌進行分離、培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基上計算菌落數(shù)量來表征［10-11］。人工方法較大的依賴于人的感官判斷，而真菌菌落計數(shù)需要培養(yǎng)5 d以上，耗時較長。同時，這些方法都無法對柑橘鮮果早期受真菌侵染進行判定。

麥角甾醇，別名24β-甲基膽固醇-5，7烯-3β-烴基，是存在于真菌細胞膜中的一種固醇類化合物，大多以自由態(tài)存在于真菌細胞膜的磷脂雙分子層中，少量酯化于脂肪酸中。在高等植物中不存在麥角甾醇，其良好的特異性和穩(wěn)定性可以有效地表征高等植物中真菌的生物量，反映植物受真菌侵染的程度［12］。目前，麥角甾醇檢測方法有高效液相色譜法［13-17］、紫外可見分光光度法［17］以及質(zhì)譜法［18］等。

本研究通過溶劑加熱超聲波萃取，將柑橘中的麥角甾醇提取、純化、濃縮富集后進行衍生化處理，應用氣相色譜-質(zhì)譜（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀，在選擇離子模式下對衍生化后的麥角甾醇進行定量測定，并對所建立的檢測方法進行評價。通過麥角甾醇含量的變化反映柑橘受真菌侵染情況，以達到有效監(jiān)控柑橘早期霉變的目的，從而保證柑橘質(zhì)量及安全。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

柑橘：市售；麥角甾醇標準品（純度≥99.0%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；7-去氫膽固醇（內(nèi)標）：上海安譜科學儀器有限公司；雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）（純度≥99.0%）：東京化成工業(yè)株式會社；甲醇（色譜純）：迪馬科技有限公司；二氯甲烷（色譜純）：西隴化工股份有限公司分析純重蒸；正己烷（色譜純）：美國默克公司。

1.2儀器與設備

AE200型電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；6890N氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；S900H超聲波清洗機：德國Elma公司。

1.3方法

1.3.1標準溶液的配制

準確稱取麥角甾醇標準品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準儲備液。依次用二氯甲烷稀釋麥角甾醇儲備液，配制質(zhì)量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的麥角甾醇標準曲線溶液。

準確稱取7-去氫膽固醇標準品100.0 mg，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL［21］，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標溶液。

1.3.2樣品前處理

將柑橘樣品于105℃烘箱中烘干，經(jīng)旋風磨粉碎過60目篩后備用。準確稱取2.00g柑橘樣品，置于50mL具蓋玻璃瓶中，加入20 mL重蒸后的二氯甲烷，旋緊瓶蓋，于35℃條件下超聲（超聲功率100 W、頻率50～60 Hz）萃取1 h后靜置30 min，取上層清液，用有機濾頭過濾后取1.0 mL置于2 mL色譜瓶中，加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL 7-去氫膽固醇內(nèi)標溶液后，在40℃水浴中揮干溶劑，加入300 μL BSTFA衍生化試劑，并于80℃條件下衍生化45 min，進行GC-MS分析。

1.3.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；程序升溫方式：初始溫度100℃，保持1 min，以30℃/min的升溫速率升至280℃，保持24 min，總運行時間31 min。載氣：氦氣（He）；流速1.0 mL/min，進樣口溫度260℃，進樣量2 μL，分流比10：1。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)測（selectedion monitoring，SIM），掃描范圍50～550 m/z，溶劑延遲10 min。

1.3.4定性定量的方法

定性方法：通過質(zhì)譜在50～550 m/z范圍內(nèi)全掃描麥角甾醇特征離子和麥角甾醇標準品，以保留時間定性。

定量方法：以麥角甾醇標準品外標法定量。

1.3.5萃取條件參數(shù)的選擇和優(yōu)化

選取對超聲萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時間3個參數(shù)，分別選擇用甲醇、二氯甲烷、正己烷作為萃取溶劑；選擇30℃、35℃、40℃、45℃作為萃取溫度水平；選擇30 min、45 min、60 min、120 min作為萃取時間水平，分別進行單因素試驗，獲取最佳萃取條件。

1.3.6麥角甾醇標準曲線的制作

分別取質(zhì)量濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的1.0mL麥角甾醇標準曲線溶液與100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL內(nèi)標儲備液于2.0 mL色譜瓶中。在40℃水浴中揮干溶劑后加入300 μL BSTFA衍生試劑，80℃條件下衍生45 min，備用。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定麥角甾醇的標準系列溶液和GC-MS分析，用峰面積對其相應質(zhì)量濃度進行回歸分析，得到麥角甾醇和內(nèi)標的積分峰面積，用麥角甾醇的積分峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（Y）作為縱坐標，麥角甾醇質(zhì)量濃度與內(nèi)標質(zhì)量濃度比值（X）作為橫坐標，建立麥角甾醇的標準曲線。

1.3.7方法學評價

應用方法線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）、加標回收率、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性對建立的柑橘中麥角甾醇含量測定方法進行方法學評價。

1.3.8霉變柑橘中麥角甾醇的測定方法

（1）不同貯存條件柑橘樣品中麥角甾醇含量測定

選取20個柑橘鮮果，隨機選取其中10個放置于相對濕度（relative humidity，RH）為80%、溫度28℃環(huán)境條件下，以加速真菌的生長增殖；剩余的10個放置于相對濕度20%、溫度28℃環(huán)境條件下避光保存，15 d后分別對不同貯存條件下的柑橘樣品進行麥角甾醇含量的測定。

（2）真菌侵染不同程度柑橘樣品中麥角甾醇含量測定

選取10個柑橘鮮果，放置于RH為80%、溫度28℃環(huán)境條件下，連續(xù)培養(yǎng)18 d。每3 d取樣一次，對不同霉變程度的柑橘樣品進行麥角甾醇含量的測定。

2　結果與分析

2.1萃取條件參數(shù)的選擇和優(yōu)化

通過選取對超聲萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時間3個參數(shù)，分別進行單因素試驗，以麥角甾醇在GC-MS分析的響應強度（峰面積）為評價指標，進行萃取條件參數(shù)和水平的優(yōu)化。萃取溶劑、萃取溫度和萃取時間對麥角甾醇萃取效果的影響，結果見表1、表2及圖1。

表1　不同萃取溶劑對麥角甾醇萃取效果的影響Table1 Effect of different extraction solvent on ergosterol extraction

表2　不同萃取溫度對麥角甾醇萃取效果的影響Table 2 Effect of different extraction temperature on ergosterol extraction

圖1　不同萃取時間對麥角甾醇萃取效果的影響Fig.1 Effect of different extraction time on ergosterol extraction

由表1可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度下萃取30 min時，麥角甾醇峰面積最大，為48 125，獲得較好的萃取效果；由表2可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，在不同萃取溫度下萃取30 min時，35℃萃取溫度下，麥角甾醇峰面積最大，為47 908，獲得較好的萃取效果；由圖1可知，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度下萃取時，60 min后可以達到萃取平衡。因此，最佳萃取條件為：二氯甲烷為萃取溶劑，在35℃萃取溫度條件下萃取60 min。

2.2方法評價

2.2.1線性回歸方程、檢出限和定量限

按照1.3.1配制麥角甾醇標準溶液，加入100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL7-去氫膽固醇內(nèi)標溶液后，在40℃水浴中揮干溶劑，加入300 μL BSTFA衍生化試劑，并于80℃條件下衍生化45min，進行GC-MS分析。以麥角甾醇峰面積與7-去氫膽固醇內(nèi)標峰面積的比值（Y）為縱坐標，其相應質(zhì)量濃度比值（X）為縱坐標，繪制麥角甾醇標準曲線見圖2。

圖2　麥角甾醇標準曲線Fig.2 Standard curve of ergosterol

由圖2可知，標準曲線線性回歸方程為Y=165.3X，相關系數(shù)R2=0.9999，結果表明，在5～200μg/mL質(zhì)量濃度范圍，二者線性關系良好。方法的LOD和LOQ以最低濃度點加入柑橘樣品，重復進樣10次，由測得的質(zhì)量濃度值統(tǒng)計出標準偏差，LOD以3倍標準偏差、LOQ以10倍標準偏差求得，分別為3.12 mg/kg和10.39 mg/kg。

2.2.2加標回收率

方法的回收率實驗采用基質(zhì)加標法，在樣品中加入麥角甾醇標準品，按照上述分析步驟操作，測得本底、低、中、高加標4個水平下的各麥角甾醇的含量，每個水平平行測定3次，計算方法回收率［（加標測定值-本底值/加標量）］及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3。

表3　加標回收率試驗結果Table 3 Results of standard recovery rate tests

由表3可知，麥角甾醇的平均回收率在91.33%～100.14%，相對標準偏差（RSD）在0.09%～1.31%。說明該方法準確度較好，能夠滿足定量分析要求。

2.2.3方法的重復性和再現(xiàn)性

采用1個霉變柑橘樣品，每天平行測定6次麥角甾醇含量，連續(xù)測定3 d，分別計算日內(nèi)相對標準偏差（RSD，n=6）及日間相對標準偏差（RSD，n=3），結果見表4。由表4可知，日內(nèi)相對標準偏差為0.04%～0.49%，日間標準偏差為0.22%，均在1%以內(nèi)，滿足檢測需求。

表4　重復性和再現(xiàn)性試驗結果Table 4 Results of repeatability and reproducibility tests

2.3麥角甾醇含量檢測方法在柑橘中的應用實驗

2.3.1不同貯存條件下柑橘樣品中麥角甾醇含量的測定

按照1.3.8中兩種不同貯存條件處理柑橘樣品，15 d后，測定其柑橘樣品中麥角甾醇含量結果見表5。

表5　不同條件下貯存柑橘樣品中麥角甾醇含量測定結果Table 5 Determination results of ergosterol content in fungal-contaminated citrus samples under different storage conditions

由表5可知，在相對濕度為80%環(huán)境條件下貯存的柑橘樣品中測定出麥角甾醇的含量為13.79～68.42 mg/kg，而正常柑橘樣品中麥角甾醇的含量為1.342～2.80 mg/kg，受到真菌侵染的柑橘樣品中麥角甾醇含量比正常樣品中高出10倍以上。通過肉眼觀察，存放在RH80%環(huán)境條件下的10個柑橘表現(xiàn)出不同程度的霉變；而存放在RH 20%、避光環(huán)境條件下的10個柑橘外觀正常。結果表明，當保藏條件不利于真菌生長的時候，菌絲體或孢子處于潛伏狀態(tài)，停止活動，麥角甾醇的含量處于穩(wěn)定的水平，但是當保藏條件處于高溫濕潤狀態(tài)，則有利于真菌生長，孢子萌發(fā)，菌絲體生長，麥角甾醇的含量遠高于干燥保藏條件下［19］。因此，可以通過應用麥角甾醇含量反映柑橘鮮果是否受到霉菌侵染，快速有效的發(fā)現(xiàn)鮮果真菌危害，及時采取防治措施。

2.3.2真菌侵染程度不同的柑橘樣品測定

對10個不同真菌侵染程度柑橘樣品進行麥角甾醇含量的測定，結果見圖3。

圖3　不同真菌侵染程度的柑橘樣品中麥角甾醇含量變化趨勢Fig.3 Variation trend of ergosterol contents in fungal-contaminated citrus samples with different levels

由圖3可知，隨著受到真菌侵染時間的增長，麥角甾醇的含量逐漸增加，在第18天時達到最大值。同時，也發(fā)現(xiàn)在第12天時出現(xiàn)一個拐點，增加的速度加快；15d后急劇增加，在3 d內(nèi)迅速增加到其實濃度的30倍以上。因此，通過麥角甾醇含量的變化可以判斷柑橘受真菌侵染的時間。

3　結論

本實驗建立了采用溶劑加熱超聲波萃取-衍生化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定柑橘中麥角甾醇含量的方法，并以麥角甾醇含量的變化來判斷柑橘受真菌侵染情況。得出如下主要結論：

（1）對萃取影響較大的萃取溶劑、萃取溫度和萃取時間3個參數(shù)進行優(yōu)化。結果表明，以二氯甲烷為萃取溶劑，35℃萃取溫度條件下萃取60 min能達到較好的萃取效果。

（2）麥角甾醇在5～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍具有良好的線性關系（R2=0.9999）；檢出限和定量限分別為3.12mg/kg、10.39 mg/kg，加標回收率范圍在91.33%～100.14%，日內(nèi)相對標準偏差為0.04%～0.49%、日間相對標準偏差為0.22%。該方法簡便、靈敏、準確。

（3）對不同霉變程度的柑橘樣品中麥角甾醇進行了測定，結果顯示新鮮健康的柑橘中麥角甾醇含量極低，隨著霉變程度的加深，麥角甾醇含量增加，麥角甾醇含量可作為反映柑橘早期受真菌侵染的重要指標。

［1］張梁，周杰，朱蔚，等.HPLC-DAD-ESI-MSn和GC-MS比較陳皮、橘皮和霉變橘皮中的化學成分［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（4）：192-199.

［2］張恒，許兆棠，李文謙，等.還原糖及維生素C含量變化與香蕉霉變進程的關系［J］.中國南方果樹，2012，41（2）：71-74.

［3］周亮，楊文俠，鐘八蓮，等.贛南臍橙貯藏期間霉變病菌分離及抑菌實驗研究［J］.贛南師范學院學報，2013，34（3）：45-49.

［4］張大為，張潔，李猛.分離引起柑橘腐爛、霉變的微生物及生物防治［J］.生物加工過程，2011，9（4）：54-57.

［5］王春紅.柿餅霉變及其防霉技術研究［D］.西安：陜西師范大學，2010.

［6］李冬娟.釀造用原輔料中霉菌的分離鑒定及霉變原輔料對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)和安全性的影響［D］.西安：西北大學，2010.

［7］張楠楠.基于嵌入式系統(tǒng)的糧食霉變檢測裝置研究［D］.淄博：山東理工大學，2014.

［8］朱建云，趙德安，潘天紅，等.基于人工嗅覺的糧食霉變識別方法的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2005，21（1）：106-109.

［9］JOHANNES R，ERLAND B.Growth of saprotrophic fungi and bacteria in soil［J］.FEMS Microbiol Ecol，2011，78（1）：17-30.

［10］TANG W，KUEHN T H，SIMCIK M F.Effects of temperature，humidity andairflowonfungalgrowthrateonloadedventilationfilters［J］.J Occup Environ Hyg，2015，12（8）：525-537.

［11］TAIPALE S J，HILTUNEN M，VUORIO K，et al.Suitability of phytosterols alongside fatty acids as chemotaxonomic biomarkers for phytoplankton［J］.Front Plant Sci，2016，7：1-16.

［12］曹龍輝，李曉珺，趙文紅，等.麥角甾醇的研究進展［J］.中國釀造，2014，33（4）：9-12.

［13］何學超，郭道林，蘭盛斌，等.糧食中麥角甾醇含量正相液相色譜法檢測［J］.糧食儲藏，2008，37（2）：43-46.

［14］劉晶京，黃文華，呂明亮，等.HPLC法測定不同品種及段木栽培靈芝子實體中麥角甾醇含量［J］.中藥材，2011，34（2）：187-190.

［15］鄧婧，黃宏南，林宏琳.高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定游離麥角甾醇的含量［J］.海峽預防醫(yī)學雜志，2011，17（1）：56-58.

［16］劉云花，李輝章，姜濤，等.影響液相色譜檢測麥角甾醇結果的因素［J］.糧油倉儲科技通訊，2012，36（2）：41-42.

［17］單慰曾，陸斌，徐霞，等.紫外光譜檢測香菇液體和固體菌絲麥角甾醇［J］.植物生理學通訊，1989（2）：67-70.

［18］LEEFMANN T，HEIM C，SILJESTR?M S，et al.Spectral characterization of ten cyclic lipids using time-of-flight secondary ion mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Sp，2013，27（5）：565-581.

［19］何學超，郭道林，蘭盛斌，等.麥角甾醇可作為評價糧食質(zhì)量安全的敏感指標之一［J］.糧食儲藏，2007，36（6）：22-26.

TANG Yanbin1，DUAN Xiaoyan3，WANG Lijuan1，CHEN Di1，YANG Lei2*
（1.National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China，Beijing 100050，China；2.Testing Centre，Yunnan Comtestor Co.，Ltd.，Kunming 650106，China；3.School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650092，China）

A quantitative determination method by GC-MS with synchronize seletion ion monitoring/full scan mode was established by using 7-dehydrocholesterlo as internal standard.The contents of ergosterol in fungal-contaminated citrus with different levels were determined.The results showed that the calibration curve exhibited good linearity with a correlation coefficientR2of 0.999 9 in the range of 5-200 μg/ml.The limit of detection（LOD）and limit of quantitation（LOQ）were 3.12 mg/kg and 10.39 mg/kg，respectively.The adding standard recovery rate ranged from 91.33%to 100.14%with the intra-day relative standard deviation of 0.04～0.49%and inter-day relative standard deviation 0.22%.The method was simple，sensitive and accurate，and ergosterol contents could be as an important indicator in early fungal-contaminated citrus.

ergosterol；citrus；fungal contamination；GC-MS

O657.63

0254-5071（2016）06-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.011

2016-04-29

國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’（2010AA023004）

唐艷斌（1983-），女，助理研究員，博士，主要從事食品生物術及營養(yǎng)與健康研究工作。

楊蕾（1983-），女，工程師，博士，主要從事食品分析檢測研究工作。