李東偉，曹美霞，宋陽陽，于立恒，李永民，李焰焰，屈長青

（1.阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽236037；3.阜陽市人民醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，安徽 阜陽 236000）

小檗堿對3T3-L1前體脂肪細胞增殖與分化的影響

李東偉1，2，曹美霞1，2，宋陽陽1，2，于立恒3，李永民1，2，李焰焰1，2，屈長青1，2

（1.阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽236037；3.阜陽市人民醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合科，安徽 阜陽 236000）

為探討小檗堿對前體脂肪細胞增殖和分化的影響，本文通過MTT法檢測3T3-L1前體脂肪細胞增殖和油紅O染色與酶標儀檢測細胞內(nèi)甘油三酯含量等分析小檗堿對其細胞形態(tài)及功能的影響；通過實時熒光定量PCR方法檢測前體脂肪細胞成脂分化相關(guān)基因的表達水平，分析小檗堿影響其成脂分化可能的作用途徑。結(jié)果表明，小檗堿濃度高于20 μmol·L-1時抑制3T3-L1細胞增殖，甚至出現(xiàn)部分細胞死亡，而5 μmol·L-1小檗堿對其抑制作用較弱；小檗堿濃度越大對3T3-L1細胞內(nèi)脂滴堆積的抑制作用越明顯；實時熒光定量PCR檢測表明，不同濃度的小檗堿明顯抑制C/EBPβ和SREBP-1c的基因表達，且其能夠通過影響miRNA表達而發(fā)揮更廣泛的作用。

小檗堿；前體脂肪細胞；增殖；分化；影響

小檗堿（berberine，BBR）是黃蓮的主要活性成分，故又名黃連素，為黃色針晶或核晶，主要存在于小檗科、罌栗科、毛莨科、蕓香科等植物中，屬于異喹啉類生物堿。BBR作為主要成份的中成藥品種，具有廣譜抗菌作用，對多種革蘭陽性菌、革蘭陰性細菌以及真菌均有抑制和殺滅作用，近年還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它有抗心律失常、利膽、改善充血性心力衰竭、降血糖、降血脂等藥理作用［1］，其中降血脂功能倍受關(guān)注，特別是在糖尿病的臨床治療中［2，3，4］，但對于其作用機理仍不明確。本實驗通過細胞培養(yǎng)和實時熒光定量PCR試驗等觀察BBR 對3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化過程中細胞變化及其標志基因表達的影響等，為研究BBR在脂類代謝中的作用機理提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

3T3-L1細胞株購自中科院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Hyclone；BBR，二甲基亞砜（DMSO），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX），MTT，油紅O，地塞米松，胰島素，羅格列酮，Trizol 和lipo2000購自Sigma；Dual-Glo Luciferase Assay System購自Promega；miR-143 mimics和inhibitor購自上海吉瑪公司；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒及miRNA通用下游引物購自TaKa-Ra，其余引物由上海生工公司合成。

倒置熒光顯微鏡購自奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱和Nanodrop分光光度計購自賽默飛世爾公司；酶標儀購自BioTeK公司；梯度PCR儀購自Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.2方法

1.2.13T3-L1前體脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導分化

使用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在5%CO2、37℃及飽和濕度下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3T3-L1細胞，隔天換液，待細胞生長匯合度達約90%時進行傳代。當生長狀態(tài)良好的3T3-L1細胞增殖至接觸抑制后，使用含有地塞米松1.0 μmol·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1、胰島素0.2 mg·L-1、羅格列酮5.0 μmol·L-1和10%FBS的高糖DMEM進行誘導成脂培養(yǎng)48 h，之后換用含胰島素0.2 mg·L-1、地塞米松1.0 μmol·L-1和10%FBS的高糖DMEM維持培養(yǎng)48 h，再換用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，至8～12 d觀察3T3-L1細胞成脂分化程度。在開始誘導成脂分化時BBR處理組培養(yǎng)基中分別加入5、10和20 μmol·L-1的BBR。

1.2.2MTT檢測BBR對3T3-L1前體脂肪細胞

增殖和成脂分化的影響

將3T3-L1前體脂肪細胞以1×104mL-1接種到96孔板，每孔200 μL，在5%CO2、37℃和飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，24 h后小檗堿處理組培養(yǎng)基更換為分別含有5、10和20 μmol·L-1BBR的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后每孔加入5 mg· mL-1的MTT 20 μL再培養(yǎng)4 h，隨后吸出培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，搖晃10 min后使用酶標儀測490 nm處吸光度。

將3T3-L1前體脂肪細胞按上述方法進行誘導成脂分化8 d后，進行油紅O染色，拍攝照片；異丙醇萃取甘油三酯（triglyceride，TG），使用酶標儀測量490 nm處吸光度。

1.2.3BBR對3T3-L1脂代謝相關(guān)基因表達影響

將3T3-L1前體脂肪細胞進行誘導成脂分化4和8天后使用Trizol試劑抽提法分別抽提總RNA，Nanodrop分光光度計檢測其質(zhì)量。使用Takara D358試劑盒將各組細胞合格的總RNA等量逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后進行實時熒光定量PCR檢測?；驑俗R號及合成引物見表1；反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃31 s，40個循環(huán)。U6為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.2.4雙色熒光素酶活性檢測試驗

將含目的基因3'UTR區(qū)域片段克隆至pMIR質(zhì)粒中，通過測序檢測，證明刪除突變成功；如圖1進行相應(yīng)分組；EP管中分別加入300 μL serumfree DMEM培養(yǎng)基，再分別加入各組質(zhì)粒，每孔1μg pMIR質(zhì)粒，0.1 μg Renilla質(zhì)粒，miRNA mimics終濃度為20 nmol·L-1；轉(zhuǎn)染試劑直接加入serum-free DMEM medium，靜置后將含lipo2000的培養(yǎng)基等體積加到含質(zhì)粒的培養(yǎng)基中；混合培養(yǎng)液靜置20 min后，加入HEK293T細胞生長旺盛的培養(yǎng)液中，每孔約100 μL；6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細胞進行雙色熒光素酶活性檢測。

1.3統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ONE WAYANOVA），方差分析采用LSD法。

表1　引物合成

2　結(jié)果

2.1BBR抑制3T3-L1前體脂肪細胞的增殖

含有不同濃度BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)3T3-L1細胞，培養(yǎng)4 d和8 d均抑制其增殖，含20 μmol·L-1BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d和8 d時均顯示了較強的抑制作用，而含5 μmol·L-1BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d時其抑制作用較弱（圖1）。

2.2BBR對3T3L1前體脂肪細胞成脂分化作用

成脂誘導前48 h，將BBR加入誘分化培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，細胞正常生長4天或8天后經(jīng)油紅O染色和異丙醇萃取TG檢測判斷BBR對3T3-L1成脂分化的影響。結(jié)果顯示：BBR濃度越高越抑制3T3-L1細胞的成脂分化（表2）；3T3-L1細胞在分化前呈成纖維細胞樣生長，在分化誘導后細胞里出現(xiàn)脂滴而趨圓變大，但在試驗過程中可以觀察到脂滴較少聚集或聚集速率較慢（圖2）。

2.3BBR對3T3-L1細胞成脂分化相關(guān)基因表達的影響

3T3-L1細胞誘導分化過程中加入不同濃度BBR培養(yǎng)四天后收集細胞，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR檢測，分析BBR對成脂分化相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果顯示不同濃度BBR抑制C/EBPβ和SREBP-1c基因表達，對miR-143基因表達影響呈先升后降變化（圖3）。

表2　不同濃度BBR對細胞TG含量的影響

圖2　BBR對細胞成脂分化的影響（油紅O染色，×100）

2.4miR-143靶向調(diào)控MAP2K5

通過生物信息學預(yù)測和分析miR-143的候選靶基因，選定MAP2K5作為miR-143的待驗證靶基因進行雙熒光素酶活性檢測實驗，結(jié)果表明：miR-143能夠引起MAP2K5表達下調(diào)，表明其是miR-143潛在的靶基因（圖4）；通過熒光定量RTPCR檢測亦發(fā)現(xiàn)，miR-143表達水平高，則MAP2K5 mRNA表達水平較低（圖5）。

3　討論

肥胖是常見的能量代謝性疾病，是引起糖尿病、高血壓和心腦血管等多種疾病的主要因素，目前認為其主要是由機體脂肪細胞數(shù)目增多和體積增大引起的。近年來，脂肪細胞分化的調(diào)控與肥胖和糖尿病發(fā)病機制的關(guān)系等一直是國內(nèi)外研究的熱點。研究中藥對脂肪細胞分化的影響，對于防治與肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)的糖尿病、血脂異常、動脈粥樣硬化及高血壓等代謝性疾病的發(fā)生及減輕其危害有重要意義。

圖3　BBR對3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化相關(guān)基因表達的影響（*P＜0.05；**P＜0.01）

圖4　雙色熒光素酶活性試驗檢測miR-143 對MAP2K5的調(diào)控

圖5　熒光定量RT-PCR檢測MAP2K5表達水平

BBR在傳統(tǒng)中醫(yī)中被長期用于治療由細菌感染引起的腸胃疾病，目前其降血脂的功效已得到部分實驗證實。Yin等［5］報道，BBR對實驗大鼠脂代謝有顯著的改善作用，能使普食鼠和高脂鼠的血清游離脂肪酸分別下降14%和24%。孔維佳等［6］在實驗研究中發(fā)現(xiàn)高血脂金黃地鼠每千克灌胃小檗堿100 mg，10天后血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度都有明顯的下降，還可以上調(diào)金黃地鼠肝臟中LDLR mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平，而且能明顯減少肝組織中中性脂肪的含量。對小檗堿作用機理研究的部分結(jié)果表明，小檗堿能明顯抑制3T3-L1脂肪細胞的分化程度及脂肪細胞分化相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα基因的表達［7］；小檗堿加成脂誘導劑能明顯降低3T3-L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞時TG的堆積與合成［8］。本文實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)液中含高劑量BBR時能夠抑制3T3-L1前體脂肪細胞增殖，而當BBR劑量低于5 μmol·L-1時，其抑制作用較弱。已有研究也表明，低濃度小檗堿可以顯著促進前脂肪細胞的增殖，抑制脂肪細胞的增殖［9，10］，可見BBR對脂肪沉積的作用與其濃度有關(guān)。通過小檗堿加誘導劑培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細胞成脂分化后，經(jīng)油紅O染色和細胞內(nèi)甘油三酯含量檢測，證實小檗堿抑制其成脂分化，劑量高或作用時間長其抑制作用越明顯。通過實時熒光定量PCR檢測成脂分化相關(guān)基因C/EBPβ和SREBP-1c，證實BBR抑制C/EBPβ和SREBP-1c表達，有研究表明這兩基因有助于PPARγ基因表達［11］，也有文獻報道小檗堿抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表達［12］，顯示BBR抑制前體脂肪細胞分化成熟可能是通過調(diào)控一系列脂分化相關(guān)基因的表達實現(xiàn)的，AMPK信號通路也可能參與其中［13］。另外還有研究顯示，BBR涉及miRNA調(diào)控，例如BBR誘導肝細胞癌P53上調(diào)就可能與miR-23a調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)［14］。miRNA是一類長約22個核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達來調(diào)節(jié)細胞功能。其中，miR-143參與脂肪分化過程被廣泛報道。較早研究顯示，高脂飼喂的小鼠脂肪沉積與miR-143表達上調(diào)有關(guān)［15］，miR-143能夠通過調(diào)控ERK5促進脂肪前體細胞分化［16］，也能夠通過調(diào)控PTN促進脂肪分化［17］，或是通過下調(diào)肥胖小鼠體內(nèi)的氧化固醇結(jié)合蛋白8而消弱胰島素刺激對AKT的激活作用和血糖平衡［18］。全基因組及計算模型分析都顯示一個miRNA可以靶向調(diào)控數(shù)百個基因［19，20］，miRNA通過共調(diào)控功能相關(guān)的多個基因從而產(chǎn)生巨大作用［21］。在本實驗中，我們通過雙色熒光素酶活性檢測試驗和熒光定量RT-PCR檢測揭示了miR-143也可以靶向負調(diào)控MAP2K5，從而對MAPK信號通路產(chǎn)生影響。已有研究表明，MAPK信號同路與脂肪細胞分化密切相關(guān)［22，23］。在脂肪細胞生長過程中，BBR濃度與miR-143表達量存在負相關(guān)，低濃度的BBR能夠促進miR-143表達，而高濃度BBR會抑制miR-143表達。BBR的存在能夠影響脂肪細胞中miR-143的表達，進而可以影響miR-143對MAPK信號通路的調(diào)控。

目前，健康養(yǎng)生已是衣食無憂的人們關(guān)心的重要話題之一了，傳統(tǒng)中藥用于健康養(yǎng)生也深入民心，而肥胖癥和糖尿病等的發(fā)病率也是逐年攀升。深入研究傳統(tǒng)中藥的作用機理，將為推廣加快傳統(tǒng)中藥發(fā)展奠定牢固的基石。黃蓮是具有悠久歷史的傳統(tǒng)中藥，其作用廣泛，藥效顯著，因此我們應(yīng)該對其有效成分的作用機理深入研究，讓其為人們的健康養(yǎng)生做出更大的貢獻。

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Effects of berberine on 3T3-L1 preadipocytes proliferation and differentiation

LI Dong-wei1，2，CAO Mei-xia1，2，SONG Yang-yang1，2，YU Li-heng3，LI Yong-min1，2，LIYan-yan1，2，QU Chang-qing1，2

（1.School of Biological and Food Engineering，F(xiàn)uyang Normal University，F(xiàn)uyang Anhui 236037，China；2.Anhui Province Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，F(xiàn)uyang Anhui 236037，China；3.Department of Integrated Chinese and Western Medicine，People's Hospital of Fuyang，F(xiàn)uyang Anhui 236000，China）

To investigate the effects of berberine on the proliferation and differentiation of preadipocytes，the multiplication of 3T3-L1 preadipocytes was detected by MTT method，and lipid droplets accumulated in preadipocytes were observed by oil O staining and quantified by colorimetry，and the expression of genes related to preadipocytes differetiation was analyzed by realtime RT-PCR.The results showed that the concentration of berberine over 20 μmol·L-1could lead to the inhibitation of 3T3-L1 preadipocytes proliferation，cells death，and the inhibitory effect of 5 μmol·L-1berberine was weak on its proliferation；Meanwhile，the accumulation of intracellular lipid droplets was more suppressed when 3T3-L1 preadipocytes treated with higher concentration of berberine；The expression of differentiation related factor C/EBPβ and SREBP-1c was downregulated and the effect on miR-143 gene expression displayed a dose-dependent manner by real-time PCR analysis.BBR weakens adipogenesis by impairing miR-143 expression maybe indirectly and provokes comprehensive changes in function.

berberine；preadipocytes；proliferation；differentiation；effects

Q291；R285.5

A

1004-4329（2016）02-050-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2016）02-050-05

2016-01-15

阜陽師范學院省級科研機構(gòu)委托專項（2013KSLZX01）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（AH201310371043）；教育部高校博士點專項（20113418120002）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才計劃重點項目（gxyqZD2016195）；安徽省自然科學基金項目（1508085QC59）；國家自然科學基金項目（31101696）資助。

李東偉（1978－），男，博士，講師，研究方向：動物遺傳發(fā)育研究。