葸玉琴,趙運(yùn)旺,馬梅蘭,曾家豫,廖世奇

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州　730070；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究中心，甘肅蘭州　730050)

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瓊脂磁珠消減SELEX技術(shù)篩選HIV P24抗原適配體

葸玉琴1,趙運(yùn)旺1,馬梅蘭1,曾家豫1,廖世奇2*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究中心，甘肅蘭州730050)

建立以羧基化瓊脂磁珠為篩選介質(zhì)，快速篩選高特異性、高親和力的HIV P24抗原適配體的方法.利用消減SELEX技術(shù)及靶標(biāo)替換的方法，以HIV P24抗原作為靶分子，羧基化瓊脂磁珠為載體，進(jìn)行6輪篩選，篩選到3條特異性核酸適配體.特異性檢測表明，篩選得到的HIV P24抗原適配體與HIV P24抗原的結(jié)合解離常數(shù)均在納摩爾級水平.該方法為HIV早期檢測提供了新的檢測技術(shù)，對適配體與靶分子相互作用機(jī)理的研究具有重要價值.

HIV P24抗原；消減SELEX技術(shù)；DNA適配體；靶標(biāo)替換

P24抗原是HIV-1的核心抗原，機(jī)體感染HIV-1后，P24在血清中出現(xiàn)的時間較早，一般在HIV-1感染后2～3周就可以檢測，可作為艾滋病窗口期檢測的血清標(biāo)志物，通過檢測血液中的P24，可達(dá)到早期診斷和治療的目的[1].DNA適配體相比于抗體檢測具有許多優(yōu)點(diǎn)：① DNA適配體更穩(wěn)定，不易降解，可長期保存[2-3]；② 篩選周期一般1～2個月[4-5]；③ 無免疫原性[6-7]；④ 變性、復(fù)性速度較快，可反復(fù)使用[8]，可在室溫下運(yùn)輸、保存；⑤ 易于化學(xué)修飾[9].本文利用靶標(biāo)替換消減SELEX技術(shù)通過6輪篩選快速得到HIV P24抗原適配體,篩選周期為10～15 d,明顯地縮短了篩選周期,提高了篩選效率.

1　材料與方法

1.1實驗材料

ssDNA文庫序列(88 nt,1.2 nmol,OD 1.0) 5’-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-40N-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’(N=A、G、T、C)；上游引物P7序列5’-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3’(9.6 nmol，OD 2.0)；下游引物P11序列5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’(4.2 nmol，OD 1.0)及Bio-P11(4.2 nmol，OD 1.0)引物(上海生物工程有限公司)，羧基化瓊脂磁珠由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)中心提供.

鏈霉親和素(1 mg·mL-1)(上海生物工程有限公司)；HIV P24抗原(2 mg·mL-1)、羊抗HIV P24多抗(2 mg·mL-1)、HIV gp41抗原(6 mg·mL-1)、辣根過氧化物酶-標(biāo)記的山羊抗人HIV P24抗體(0.2 mg·mL-1)(北京科衛(wèi)有限公司)，去離子水；封閉液(0.1 g蔗糖，12.5 mg牛血清白蛋白，12.5 mg酪蛋白溶在10 mL 1×Binding buffer中)；1×Binding buffer(137 mmol NaCl,2.7 mmol KCl,6.5 mmol Na2HPO4,1.8 mmol NaH2PO4,2.5 mmol MgCl2,1 mmol CaCl2)；0.05% Tween-20的1×Binding buffer溶液(將Tween-20的母液稀釋至25%，再按比例用1×Binding buffer將其稀釋至0.05%).

1.2HIV P24抗原活性檢測

以羧基化瓊脂磁珠作為載體，通過ELISA實驗檢測HIV P24抗原的活性.操作過程如下[10]：

取0.1 mL羧基化瓊脂磁珠，等量分成兩份，一份作為陽性(+)；一份作為陰性(-)，放置于1.5 mL EP管中，然后標(biāo)記“+”的載體加入用純水稀釋100倍的HIV P24抗原50 μL，“-”加入等體積的純水，并設(shè)置兩組平行樣，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育2 h；分別棄去上述載體中孵育的液體，用1×Binding buffer洗3遍，各加入配制好的封閉液1 mL，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；分別棄去上述載體中的一抗，用含0.05% Tween-20的1×Binding buffer洗4遍，各加入稀釋2 000倍的HRP-標(biāo)記的山羊抗人HIV P24抗體50 μL，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育2 h；分別棄去上述載體中的二抗，用含0.05%Tween-20的1×Binding buffer洗4遍，各滴入一滴底物A、底物B，然后置于37 ℃恒溫調(diào)速搖床，避光顯色15 min.顯色結(jié)束后各滴入一滴終止液；將終止顯色反應(yīng)后的液體各取100 μL，置于酶標(biāo)儀(490 nm的波長，快速振蕩2 s)，讀取對應(yīng)的OD值.

1.3消減SELEX技術(shù)篩選HIV P24抗原適配體

1.3.1正篩取0.5 mL羧基化瓊脂磁珠放置于1.5 mL EP管中，加入用純水稀釋的HIV P24抗原500 μL(稀釋100倍)，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；用1×Binding buffer洗3遍，加入1 mL封閉液，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；包被HIV P24抗原的羧基化瓊脂磁珠用1×Binding buffer洗3遍，與ssDNA庫(用3 mL 1×Binding buffer溶解ssDNA庫，95 ℃加熱10 min,冰浴5 min)結(jié)合，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h.用1×Binding buffer洗3遍，加入500 μL 1×Binding buffer，95 ℃加熱5 min，12 000 r·min-1離心5 min，重復(fù)上述步驟3次，共收集1 500 μL上清，作為下一輪篩選的ssDNA次級庫.然后將ssDNA通過qRT-PCR擴(kuò)增得到dsDNA.

1.3.2瓊脂磁珠法制備ssDNA取0.2 mL羧基化瓊脂磁珠放置于1.5 mL EP管中，加入用純水稀釋的鏈霉親和素200 μL(稀釋100倍)，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育2 h；包被鏈霉親和素的羧基化瓊脂磁珠用1×Binding buffer洗3遍，與dsDNA孵育，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；棄去上述載體中孵育的液體，用TPBS，40 ℃水浴，每次3 min，重復(fù)3次.加入200 μL 1×Binding buffer，95 ℃加熱5 min，收集上清作為下一輪篩選的ssDNA次級庫.

1.3.3反篩取0.2 mL羧基化瓊脂磁珠放置于1.5 mL EP管中，標(biāo)記為“1”，即正篩管，偶聯(lián)HIV P24抗原；取等量的羧基化瓊脂磁珠放置于1.5 mL EP管中，標(biāo)記為“2”，即反篩管，偶聯(lián)HIV gp41抗原,正篩管、反篩管置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；反篩管先與制得的ssDNA結(jié)合，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；吸取反篩管中的ssDNA加入到正篩管中，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；正篩管、反篩管用TPBS洗5遍，加入100 uL純水95 ℃加熱5 min，12 000 r·min-1離心5 min,重復(fù)上述步驟3次，共收集300 μL上清，為下一輪篩選的ssDNA次級庫.

重復(fù)上述篩選步驟，并在每輪篩選中加入tRNA非特異性競爭劑進(jìn)行篩選，增加篩選的特異性.共進(jìn)行6輪篩選.

1.3.4qRT-PCR檢測ssDNA富集程度配制qRT-PCR體系(PCR buffer 10 μL，dNTP 0.8 μL，P7 0.4 μL，Bio-P11 0.4 μL，熒光 1 μL，rTaq酶2 μL，純水 85.4 μL)，充分混用，每管24 μL，分成4管.分別加入陽性上清、陰性上清、純水各6 μL，qRT-PCR檢測.篩選中采用靶蛋白用量分別為1～2輪6 μL，3～5輪3 μL，6輪1.5 μL，直到第6輪次級庫為最終文庫.

1.4HIV P24抗原適配體的克隆測序

經(jīng)過6輪篩選，將篩選產(chǎn)物進(jìn)行PCR并經(jīng)非變性 PAGE切膠回收dsDNA，連接pMDTM18-Tvector轉(zhuǎn)化到 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，同時設(shè)立陽性對照與陰性對照，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取所有陽性克隆，鑒定其與HIV P24抗原的結(jié)合能力，并將鑒定后的陽性克隆送上海生工測序.

1.5HIV P24抗原適配體特異性檢測

按照不對稱PCR法制備ssDNA，配制不對稱PCR體系[11](10×Buffer 10 μL，dNTP 0.8 μL,P7 2 μL,P11 0.2 μL,rTaq酶 1 μL，純水86 μL)，充分混勻，每管9 μL,再分別各加1 μL陽性克隆菌液.按(95 ℃，5 min；94 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，5 min)這個條件擴(kuò)增30個循環(huán).擴(kuò)增產(chǎn)物待用.然后取2份等量羧基化瓊脂磁珠，分別為標(biāo)記“1”、“2”.“1”管即篩選管，偶聯(lián)HIV P24抗原，“2”管偶聯(lián)HIV gp41抗原.“1”、“2”EP管置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h,棄去上述載體中孵育的抗原，“1”、“2”EP管各加入100 μL ssDNA，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h；棄去載體中的ssDNA，“1”、“2”EP管分別用TPBS洗5遍，分別加入100 μL純水，95 ℃加熱5 min，12 000 r·min-1離心5 min，qRT-PCR檢測.

1.6HIV P24抗原適配體識別靶蛋白的親和力

選用8個不同的濃度，即HIV P24抗原適配體稀釋倍數(shù)分別為100倍，200倍，300倍，400倍，500倍，600倍，700倍以及原液，分別與包被HIV P24抗原羧基化瓊脂磁珠結(jié)合，置于37 ℃滾筒式恒溫振蕩器中孵育1 h.選擇適配體4，5，12作為備選的適配體，用ELISA的方法[12]進(jìn)一步測定各自的親和力(Kd)大小.

1.7測序分析

測序結(jié)果先在核酸適配體序列查詢數(shù)據(jù)庫中檢索(http://www.aptagen.com∕aptamer-index∕aptamer-list.aspx)，先排除已知的序列，進(jìn)行比對分析，用RNA structure 5.3軟件預(yù)測分析二級結(jié)構(gòu).

2　結(jié)果與分析

2.1HIV P24抗原活性測定分析

ELISA技術(shù)是目前應(yīng)用最為普遍的免疫分析方法，具有靈敏性好，特異性強(qiáng)，便于操作等優(yōu)點(diǎn)，因此得以在抗原、抗體活性測定領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13].根據(jù)ELISA測定分析，陽性均值是陰性均值的2.1倍說明檢測的抗原有活性.在檢測過程中為了提高ELISA實驗的穩(wěn)定性，陽性、陰性組各重復(fù)3組.檢測結(jié)果表明，陽性三組平行樣均值完全高于陰性均值，陽性均值是陰性均值的21.97倍，證明從試劑公司購買的HIV P24抗原有活性(表1).

表1　HIV P24抗原活性檢測結(jié)果

在每一輪的篩選中，HIV P24抗原的活性直接關(guān)系到能否形成穩(wěn)定的磁珠-HIV P24抗原化學(xué)偶聯(lián)復(fù)合物.HIV P24抗原的活性高，有利于特異性的ssDNA與HIV P24抗原的結(jié)合，更有利于快速篩選高特異性的HIV P24抗原的適配體.

2.2HIV P24抗原適配體篩選

本實驗通過2輪正篩和4輪反篩，采用qRT-PCR實時檢測篩選文庫與HIV P24抗原的親和富集程度[14].第6輪正篩管和反篩管qRT-PCR檢測結(jié)果表明正篩管在反篩到第5輪的時候與HIV P24抗原結(jié)合的特異性適配體富集達(dá)到了飽和.說明用磁珠法篩選能夠快速的消除非特異性ssDNA，從而增加對特異性適配體的富集,提高了篩選效率(圖1).

圖1　6輪篩選后qRT-PCR檢測結(jié)果

每一輪篩選過程中用的ssDNA文庫與HIV P24抗原的用量直接關(guān)系到篩選是否成功.在最初兩輪篩選時，為了獲得與HIV P24抗原特異性結(jié)合的適配體，ssDNA與HIV P24抗原用量要大.后續(xù)的幾輪篩選為了篩選出特異性更高、親和力更強(qiáng)的適配體，ssDNA與HIV P24抗原的用量要逐漸減少，但ssDNA/HIV P24抗原要提高，使親和力更強(qiáng)的ssDNA結(jié)合到HIV P24抗原的結(jié)合靶點(diǎn)上，洗脫力度隨篩選輪數(shù)的增多逐漸加大，從而除去親和力較弱的ssDNA，以獲得特異性更高、親和力更強(qiáng)的適配體.

2.3HIV P24抗原適配體識別特異性

用靶標(biāo)替換消減SELEX技術(shù)篩選得到的HIV P24抗原的適配體分別與HIV P24抗原和HIV gp41抗原結(jié)合，qRT-PCR檢測結(jié)果表明，1、2分開10個循環(huán)左右，PCR體系空白和2幾乎重合，說明篩選得到的HIV P24抗原適配體只與HIV P24抗原特異性的結(jié)合，不與HIV gp41抗原結(jié)合，利用這一特異性，可以作為檢測HIV P24抗原的一種新技術(shù)(圖2).

適配體對HIV P24抗原的特異性識別能力是作為特異性分子識別探針的關(guān)鍵，因此本文考察了適配體序列與HIV P24抗原特異性識別能力.一方面在篩選過程中扣除相似非目標(biāo)靶物質(zhì)上所具有的靶分子適配體[15]，消減后的次級文庫再投入到目標(biāo)靶物質(zhì)進(jìn)行篩選，得到目標(biāo)靶分子的特異性適配體；另一方面在篩選過程中通過反篩過程,如加入蛋白封閉液以掩蔽非特異性的作用位點(diǎn)，同時逐漸地增加篩選過程中的洗脫力度以除掉非特異性吸附,這些篩選條件的嚴(yán)格控制使得到的適配體為高度特異性識別HIV P24抗原靶標(biāo).

圖2　HIV P24抗原適配體特異性檢測

2.4HIV P24抗原適配體與靶蛋白識別的親和力

通過ELISA方法測得4,5,12號適配體的親和力大小(Kd)(表2).結(jié)果顯示這3條適配體序列與HIV P24抗原結(jié)合的平衡解離常數(shù)值均在納摩爾級水平，其中4號適配體的親和力最強(qiáng)，12號適配體的親和力相對較弱，表明篩選得到的3個適配體序列與HIV P24抗原有高親和性(圖3).

圖3　Kd值檢測結(jié)果

通過消減SELEX技術(shù)篩選得到的適配體全長為40個核苷酸序列，然而實際上并不是所有的核苷酸序列都參與構(gòu)成與靶蛋白結(jié)合的識別位點(diǎn)，因此我們可以對篩選獲得的適配體序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)序列優(yōu)化[16]，更有利于適配體在實際應(yīng)用中的合成與設(shè)計，可作為HIV早期檢測分子識別探針.

2.5序列比對

共篩選得到18個陽性克隆測序，但只獲得3條不同的序列，分別為4,5,12號測序結(jié)果.分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的3條HIV P24抗原適配體序列長度均為40 bp，符合適配體的長度要求，同時在核酸適配體序列查詢數(shù)據(jù)庫中未檢索到HIV P24抗原適配體的序列，表明我們成功的獲得了3條新的HIV P24抗原適配體序列(圖4).

利用RNA structure 5.3軟件分析HIV P24抗原適配體可能的折疊方式，對獲得的3條HIV P24抗原適配體序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，未知的HIV P24抗原適配體序列片段都位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)上(圖5).

獲得的3個適配體序列的二級結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)為主，包括凸環(huán)和圓環(huán).推測莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是適配體與HIV P24抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它們可能通過疏水作用、堿基堆積力和氫鍵等作用力與靶物質(zhì)形成“鎖與鑰匙”結(jié)構(gòu)，可以通過化學(xué)修飾進(jìn)一步提高適配體與靶蛋白的特異性，為后期適配體在血清中檢測HIV P24抗原提供了理論依據(jù).

圖4　獲得的3條HIV P24抗原適配體測序圖譜

克隆序號Cloningnumber大小/(bp)Size/(bp)序列(5　-3　)Sequence(5　-3　)Kd值/(nmol·L-1)Kd/(nmol·L-1)440TCCCCCCAGAGCCGAATGCATAACCGGGTCAGCGGACGCG109+7.2540TAGTTGTGACAGTGGGTCCAAACCGGACCACGAAAGCAGA98+4.91240CCGCTGCGTTGAATCGGGTCGCCACGCCTGGTTGGAAGGA51+9.6

(A)4號序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測；(B)5號序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測；(C)12號序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測

(A)on the 4th sequence stem-loop structure prediction;(B)the 5th sequence of stem-loop structure prediction;(C)on the 12th sequence of stem-loop structure prediction

圖5新獲得的HIV P24抗原適配體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)預(yù)測

Fig 5HIV P24 antigen ssDNA with a base sequence obtained stem-loop structure prediction

3　討論

傳統(tǒng)SELEX技術(shù)采用液相結(jié)合、硝酸纖維素膜分離、酚-氯仿抽提的方法從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫中篩選出針對某一靶分子的特異性核酸適配體[17].應(yīng)用此方法篩選靶蛋白的適配體實驗周期長、篩選過程繁瑣、篩選成本較高.瓊脂磁珠是由磁性的材料制成，具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和分散性，良好的生物相容性和生物降解性等特性，表面還可以連接不同的活性基團(tuán)[18]，而且羧基化瓊脂磁珠能夠交聯(lián)感興趣的靶蛋白[19]，是篩選靶蛋白適配體良好的分離介質(zhì)，通過離心就能將瓊脂磁珠和結(jié)合在瓊脂磁珠上的配基與未結(jié)合的文庫分離開來，方法簡單實用[20].

利用消減SELEX技術(shù)以羧基化瓊脂磁珠為篩選介質(zhì)，建立快速簡單的靶分子適配體篩選方法.通過多次反篩獲得HIV P24抗原適配體.在反篩過程中進(jìn)行靶標(biāo)替換，相比于其他篩選方法，這種靶標(biāo)替換的篩選方法能夠獲得特異性更高的適配體.這種方法成本低、操作簡便，能快速、高效的去除非特異性ssDNA的富集，篩選效率得到極大地提高.適配體具有結(jié)構(gòu)的多樣性，與靶分子結(jié)合時顯示出高選擇性、高親和力和高特異性，在檢測蛋白方面，優(yōu)于傳統(tǒng)的抗原-抗體免疫手段[21,22]，具有廣闊的應(yīng)用前景.對于后期分子機(jī)理的研究，以及適配體檢測技術(shù)和藥物等相關(guān)研究具有重要作用[23].

本實驗以羧基化瓊脂磁珠為篩選介質(zhì)[24]，利用靶標(biāo)替換消減SELEX技術(shù)經(jīng)過6輪篩選，獲得了3條HIV P24抗原適配體，并對HIV P24抗原適配體識別特異性及親和力進(jìn)行了考察，這3條適配體序列與HIV P24抗原結(jié)合的平衡解離常數(shù)值均在納摩爾級水平，其中4號適配體的親和力最強(qiáng)，12號適配體的親和力相對較弱.這種適配體可以特異性的識別HIV P24抗原，不識別其它的靶分子，有利于進(jìn)一步研究篩選得到的適配體與HIV P24抗原的結(jié)合位點(diǎn)，為HIV的早期診斷提供了一種有效的工具和手段.對抗原與適配體相互作用機(jī)理的研究提供了理論基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯俞詩源)

Agar magnetic beads subtractive SELEX screening HIV P24 antigen aptamers

XI Yu-qin1,ZHAO Yun-wang1,MA Mei-lan1,ZENG Jia-yu1,LIAO Shi-qi2

(1.College of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,Gansu,China；2.Medical Molecular Biology Research Center,Gansu Academy of Medical Sciences,Lanzhou 730050,Gansu,China)

Take carboxyl agar magnetic beads as medium,a method that can rapidly screen HIV P24 antigen aptamers with high specificity and affinity is established.Use subtractive SELEX technology and target replacement method,HIV P24 antigen as the target molecules,carboxyl agar magnetic beads as the carrier,three specific aptamers are found after 6 rounds of screening.The specificity detection shows that the dissociation constant is at the nanomloe level while HIV P24 antigen aptamers are combined with HIV P24 antigen.The technology provides a new detecting technology for early HIV testing,it has important value to study of the aptamers interact with target molecular.

HIV P24 antigen；subtractive SELEX technology；DNA aptamers；target replacement

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.05.018

2016-03-04;修改稿收到日期:2016-04-06

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金資助項目(30960104；30770639)

葸玉琴(1964—),女,甘肅永昌人,副教授,碩士研究生導(dǎo)師.主要研究方向為低等植物生理生化和污染生態(tài)學(xué).E-mail:xiyuqin@nwnu.edu.cn

*通訊聯(lián)系人，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向為分子生物學(xué).E-mail:lshiqi@126.com

Q 7

A

1001-988Ⅹ(2016)05-0079-06